BRAFV600E基因突變、促甲狀腺激素和甲狀腺球蛋白預測甲狀腺結節惡變的臨床價值

趙利超，周艷紅，毛小芳，張威，曹在新

甲狀腺疾病在內分泌系統疾病中發病率較高，近年，隨著大眾健康意識的提高，甲狀腺結節的檢出率也有所增加[1]。在非碘缺乏地區的人群中，甲狀腺結節的發病率為5%，其中半數以上是在超聲檢查中發現，此部分患者甲狀腺癌的發生率為7%～15%[2]。細針穿刺活檢(fine needle aspiration biopsy，FNAB)是術前評估甲狀腺結節性質最常用的診斷技術，由于檢測技術的差異導致部分患者出現假陰性或假陽性[3]。為避免不合理的手術決定，尋找有效的術前診斷標志物具有重要的臨床價值。

研究顯示，甲狀腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)水平是分化良好的甲狀腺癌復發的有用標志物[4]。然而，在甲狀腺惡性結節的術前檢查中，Tg作為甲狀腺惡性腫瘤的預測指標仍存在爭議。甲狀腺結節患者術前促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平的增加與分化型甲狀腺癌的風險呈正相關[5],與甲狀腺癌的進展以及頸部淋巴結轉移之間存在相關性[6]；但也有研究表明，高TSH水平與甲狀腺惡性腫瘤之間無相關性[7]。BRAFV600E基因突變對甲狀腺乳頭狀癌具有較高的陽性預測價值，但在甲狀腺結節中，是否可以預測結節惡變，目前尚無明確結論。本研究檢測甲狀腺結節患者Tg和TSH的水平，以及BRAFV600E基因的突變情況，分析三者預測甲狀腺結節發生惡變的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 對象 連續性收集2019年10月—2021年10月在筆者醫院接受手術治療的甲狀腺結節患者184例，男性49例，女性135例，年齡(48.6±11.3)歲(32～58歲)。傳統開放性甲狀腺手術65例，腔鏡輔助下甲狀腺手術119例。根據病理檢測結果，惡性結節組132例，其中多結節性甲狀腺腫95例，孤立性甲狀腺結節29例，有毒甲狀腺腫8例；良性結節組52例，其中多結節性甲狀腺腫40例，孤立性甲狀腺結節11例，有毒甲狀腺腫1例。甲狀腺結節穿刺病理結果見圖1。納入標準：(1)符合甲狀腺結節的切除指征[8]；(2)術后經病理組織學確診，且為首次確診；(3)入院前未接受放化療及免疫治療；(4)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他腫瘤；(2)既往有甲狀腺手術史；(3)合并肝炎、肺炎和肺結核等急性或慢性疾病；(4)合并免疫系統或血液系統疾病；(5)失訪者。所有患者均接受甲狀腺次全切或雙側全切手術，甲狀腺惡性結節組患者術后行131I和TSH抑制劑治療。

A：惡性甲狀腺結節；B：良性甲狀腺結節。

1.2 方法

1.2.1 收集資料 記錄患者入院時的基本信息，包括性別、年齡、體質量指數(body mass index，BMI)和病理組織確診的甲狀腺組織類型。

1.2.2 測量TSH 收集患者清晨空腹血5 mL于離心管中，傾斜50° 放置于4 ℃冰箱中靜置1 h，然后于低速離心機中以3 000 r/min的速度離心5 min。將上層血清吸入新的離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存。待樣品收集完畢后，使用電化學發光免疫分析儀(CAL 2200i，深圳邁瑞公司)檢測患者外周血清中的TSH和Tg水平。

1.2.3 檢測BRAFV600E基因突變 將甲狀腺結節切除術中獲取的新鮮組織置于含0.9% NaCl的離心管中，送實驗室檢測。提取組織中的DNA，經紫外分光光度計檢測DNA濃度，采用BRAFV600E基因突變檢測試劑盒(廈門艾德生物醫藥公司)檢測DNA中BRAFV600E基因突變的情況。將突變信號Ct值≥28設為陰性，<28為陽性。

2 結 果

2.1 兩組間BRAFV600E基因突變陽性、Tg和TSH水平的比較 惡性結節組BRAFV600E基因突變陽性患者的比例、Tg和TSH水平均高于良性結節組，組間比較差別均具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組間BRAFV600E基因突變陽性、Tg和TSH水平的比較

2.2 惡性結節組BRAFV600E基因突變、TSH和Tg水平對臨床病理特征的影響 BRAFV600E基因突變陽性與腫瘤直徑、淋巴結轉移、病灶數量和TNM分期有關(P<0.05)，TSH和Tg水平與淋巴結轉移和TNM分期有關(P<0.05，表2)。

表2 惡性結節組BRAFV600E基因突變、TSH和Tg水平對臨床病理特征的影響

2.3 影響甲狀腺惡性結節的危險因素分析 自變量賦值：年齡(<55歲為0，≥55歲為1)、性別(女性為0，男性為1)、病理類型(髓樣癌為0，濾泡狀癌為1，乳頭狀癌為2)、腫瘤直徑(<2 cm為0，≥2 cm為1)、淋巴結轉移(無轉移為0，有轉移為1)、病灶數量(單發為0，多發為1)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期為0，Ⅲ+Ⅳ期為1)、BRAFV600E基因突變(陰性為0，陽性為1)。因變量賦值：甲狀腺結節(惡性為0，良性為1)。經logistic單因素和多因素回歸分析顯示腫瘤直徑≥2 cm、淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、BRAFV600E基因突變陽性、TSH水平升高和Tg水平升高均為影響甲狀腺惡性結節的危險因素(表3)。

表3 影響甲狀腺惡性結節的危險因素分析

2.4 BRAFV600E基因突變、TSH和Tg水平預測甲狀腺惡性結節的臨床價值 三者聯合檢測預測甲狀腺惡性結節的曲線下面積為0.932，高于BRAFV600E基因突變、TSH和Tg(0.835、0.754和0.752)3個指標單獨檢測(Z=3.521、4.514、4.326；P=0.014、0.006、0.009)，見圖2和表4。

Tg：甲狀腺球蛋白；TSH：促甲狀腺激素。A：BRAFV600E基因突變；B：TSH；C：Tg；D：三者聯合檢測。

表4 BRAFV600E基因突變、TSH和Tg預測甲狀腺惡性結節的ROC曲線特征

3 討 論

甲狀腺結節是臨床上的常見病，超聲檢查為首選的影像學檢查方法，超聲引導下的FNAB在甲狀腺惡性結節的診斷中使用最為廣泛，但因FNAB診斷的敏感性低而出現不確定性的診斷結果。鑒于FNAB檢測的局限性，臨床上已采用其他潛在的預測因素來檢測甲狀腺結節的惡性風險，特別是分子標記物，例如FNAB標本中的BRAF突變，有望成為預測甲狀腺癌的有效標記物[9]。既往研究表明，在不確定的FNAB細胞學檢查中，檢測Tg水平有助于甲狀腺惡性結節的診斷[10]。但迄今為止，尚無法證明Tg和TSH水平可足夠準確地用于甲狀腺癌的篩查[11]。研究表明，TSH/Tg升高是甲狀腺癌的危險因素，其與惡性腫瘤的相關性高于TSH[12]。

Tg作為甲狀腺濾泡上皮細胞分泌的特異性蛋白，不僅見于正常甲狀腺的濾泡細胞，甲狀腺腫瘤也可分泌。免疫測定法并不能區分正常甲狀腺組織分泌的Tg和惡性甲狀腺腫瘤分泌的Tg，這可能是Tg不能單獨用于診斷甲狀腺良惡性結節的原因[13]。另外，某些甲狀腺良性病變，如自身免疫性甲狀腺炎、亞急性甲狀腺炎、甲狀腺腺瘤和結節性甲狀腺腫，均可能導致甲狀腺濾泡被破壞，從而導致血清Tg水平增高[14]。部分研究也表明，術前Tg對區分惡性結節和良性腫瘤并無價值[15]。因此，各個指南均未建議在診斷甲狀腺結節時檢測外周血清Tg水平。而另一些研究則指出，Tg水平在術前具有預測甲狀腺惡性腫瘤的潛力[16]。本研究中，術前Tg水平與甲狀腺惡性結節患者的淋巴結轉移和TNM分期有關，且對甲狀腺惡性結節具有一定的預測價值。目前的研究已明確，對行甲狀腺全切或近全切以及131I消融治療后的甲狀腺惡性結節患者進行Tg定量檢測，在監測甲狀腺惡性結節復發和轉移的風險中具有重要的作用[17-18]。

TSH是另一種流行的生物標志物，被認為是分化型甲狀腺惡性結節的預測因子[19]。研究表明，血清TSH水平升高對甲狀腺結節中發生惡性腫瘤的風險是否有預測價值，尚無定論[20]。一項包括5 000 多例甲狀腺癌患者的薈萃分析顯示，TSH水平升高者患甲狀腺癌的風險比未升高者高兩倍[6]。指南還強調，較高的血清TSH水平與甲狀腺結節惡性腫瘤的發生風險有關[17]。因較易獲取、檢測速度快且成本低，目前，術前血清標志物(Tg、TSH和甲狀腺抗體)在診斷甲狀腺惡性結節的相關研究中已較為多見。然而，這些標志物在區分惡性腫瘤和良性結節方面的臨床價值還有待進一步研究。本研究顯示，惡性結節組TSH高于良性結節組，且與患者的淋巴結轉移和TNM分期有關，提示TSH水平較高的患者，患惡性結節的可能性較大。

研究顯示，對于伴有可疑超聲征象的甲狀腺結節，FANB聯合BRAFV600E基因突變檢測，有助于提高甲狀腺結節診療的準確性，篩查甲狀腺惡性結節具有較高的臨床價值[21-22]。本研究中，良性結節中并未檢測到BRAFV600E基因突變，惡性結節中檢測到的突變率為83.3%。BRAFV600E基因突變與腫瘤直徑、淋巴結轉移、病灶數量和TNM分期有關，說明BRAFV600E基因突變可促進甲狀腺惡性結節的進展。多因素回歸分析顯示，BRAFV600E基因突變為影響甲狀腺惡性結節的危險因素，故認為BRAFV600E基因突變檢測在鑒定甲狀腺良惡性結節中具有一定的臨床價值。本研究結果顯示，BRAFV600E基因突變與Tg和TSH三者聯合檢測可顯著增加診斷甲狀腺惡性結節的臨床價值。

綜上所述，甲狀腺惡性結節外周血中Tg、TSH水平增加和BRAFV600E基因突變影響甲狀腺惡性結節臨床病理特征，為甲狀腺惡性結節發生的危險因素，三者聯合檢測可提高診斷甲狀腺惡性結節的臨床價值。