禽流感與新城疫血凝試驗檢測方法

李宇剛

（山東省威海市環翠區動物疫病預防控制中心，山東 威海 264200）

0 引言

血凝抑制試驗中主要使用4單位抗原（4HAU）作為診斷液，4HAU的配置自然就成為了整個試驗中的重要環節之一，并且精確性對血凝抑制試驗的結果會造成直接影響，往往4HAU的濃度與HI抗體效價成反比。使用血凝試驗檢測的準確性會對4HAU配置的準確性造成直接的影響，為避免血凝試驗檢測的不準確，需要進一步使用回歸檢驗試驗對血凝試驗的結果進行驗證。也正是因為現存的檢測方式需要對血凝試驗、回歸檢測試驗進行多次驗證才造成診斷禽流感、新城疫的效率低下。

1 目的

希望通過本次研究設計一種禽流感和新城疫的血凝試驗檢測方法，有效避免現如今檢測技術存在的不足，不再使用常規的血凝試驗方式，改用回歸檢測試驗的方式在觀察血凝效價的基礎上對禽流感、新城疫血凝效價進行計算，并且最終獲得的結果是完全一致的[1]。實踐證明，使用本次設計的禽流感和新城疫的血凝試驗檢測方法可以提升禽流感、新城疫血凝試驗的診斷效率，并且成本更低、時間更短。

2 技術方案

2.1 禽流感和新城疫血凝試驗檢測方法步驟

（1）將禽流感血凝試驗的參照血凝效價設計為9log2，將新城疫血凝試驗的參照血凝效價設計為10log2。

（2）配置禽流感4HAU抗原時測參考《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》，血凝效價為9log2，新城疫4HAU抗原血凝效價為10log2，搖勻后開始回歸檢測試驗，對紅細胞凝集孔數量進行觀察。

（3）計算禽流感血凝效價：以上一步得出的回歸檢測實驗觀察結果作為依據，在紅細胞凝集孔數量大于2的X個時，此時的禽流感血凝效價為（9＋X）log2。在在紅細胞凝集孔數量小于2的X個時，此時的禽流感血凝效價為（9－X）log2，X取值為0、1、2。

（4）新城疫血凝效價計算：同樣結合回歸檢測試驗結果，在紅細胞凝集孔數量大于2的X個時，此時新城疫血凝效價為（10＋X）log2。在在紅細胞凝集孔數量小于2的X個時，此時新城疫血凝效價為（10－X）log2，X取值為0、1、2。

2.2 回歸檢測試驗步驟

（1）使用微量移液器在96孔V型微量反應板的1～4中加入0.025 mL PBS，形成4個平行樣本并更換滴頭。

（2）吸取經過均勻混合的4HAU抗原0.025 mL加入第1孔，再次搖勻。從第1孔中吸取0.025 mL滴入第2孔中，再次搖勻，從第2孔中同樣吸取0.025mL加入到第3孔中，一直到第4孔放棄，并更換滴頭。

（3）將體積分數1%的雞紅細胞懸液或者也可使用體積分數為0.75%的雞醛化紅細胞懸液0.025 mL加入到第1孔中。

（4）充分搖勻后，在20～25 ℃室溫環境下靜置20min以后進行觀察，傾斜放置反應板，對紅細胞凝集孔的數量進行觀察并記錄[2]。

3 實施方法

3.1 制備體積分數1%的雞紅細胞懸液

（1）抗凝劑使用阿氏液，選擇使用大于等于3只的SPF公雞或者是沒有禽流感、新城疫抗體的雞抗凝血液，置于離心管中，并在離心管中加入體積3-4倍的PBS充分搖勻，離心速度控制在2 000 r/min，時間持續5～10 min，離心后，血漿、白細胞層都會被去除。重復上述步驟并反復清洗血漿、白細胞層3次，再次以離心速度2 000 r/min，時間持續10 min[3]。完成后吸取壓積紅細胞，并使用PBS配置體積分數為1%的懸液，在恒溫4 ℃的條件下保存。

（2）配置阿式液：選擇2.05 g葡萄糖、0.8 g檸檬酸鈉、0.055 g檸檬酸、0.42 g鹽，將這些物質加入到100 mL蒸餾水中，經過散熱溶解后調整至pH為6.1，在氣壓6KPa條件下開始高溫滅菌持續15 min，完成后在恒溫4℃的條件下保存備用。

3.2 配備體積分數為0.75%的雞醛化紅細胞懸液

（1）使用0.1 mol/L PBS液充分清洗新鮮紅細胞5次，離心速度控制在3 000 r/min，時間持續4 min，使用壓縮紅細胞體積10倍的PBS液最后清洗，離心速度控制在3 000 r/min，時間持續10 min，去除上清液。

（2）以沉積紅細胞8倍加入體積分數36%甲醛溶液并且于恒溫4 ℃、體積分數為36%甲醛溶液充分混合均勻，恒溫4 ℃條件下保持24 h，并在24 h期間需要不斷振蕩。

（3）取出后，以沉積紅細胞1倍的體積作為標準，添加2倍體積分數為30%的甲醛溶液在恒溫4℃條件下進行，保持24 h，再使用PBS溶液反復沖洗5次，制備體積分數為0.75%的醛化紅細胞液，隨后加入到體積分數為0.1%的疊氮鈉中，在恒溫4 ℃的條件下保存。

3.3 檢測禽流感血凝試驗的方法

（1）材料。設備：96孔V型微量反應板、帶有滴頭的微量移液器、一次性移液槽；溶液：體積分數為1%的雞紅細胞懸液或者是體積分數為0.75%的雞醛化紅細胞懸液；原料：禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗抗原。

（2）方法。禽流感血凝試驗參照血凝效價9log2；以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》為參考依據，制備禽流感4HAU抗原血凝效價為9log2，充分混合均勻，對紅細胞凝集孔數量進行觀察：①在反應板1～4孔加入0.025mL的PBS，構成4個平行樣本，完成后更換滴頭；②取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到1孔中并充分混合均勻；③從1孔取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到2孔中，經過充分均勻混合以后同樣取出0.025 mL的4HAU混勻的抗原液加入到4孔中，再從4孔中取出0.025mL的4HAU混勻的抗原液丟棄，更換滴頭；④在每一個孔當中都加入體積分數為1%的雞紅細胞懸液0.025 mL；⑤充分混合均勻，在室溫條件20～25 ℃環境下靜置20 min觀察結果。觀察到的最終結果為紅細胞凝集孔數量為1。

（3）計算禽流感血凝效價。根據上述步驟觀察到的結果，如果在紅細胞凝集孔數量與2相比小于1時，可以得出最終的禽流感血凝效價=（9-1）log2=8 log2；結果：使用檢測禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗抗原最終的血凝效價為8log2。

4 結論

設計一種禽流感和新城疫的血凝試驗檢測方法，目的是更加準確地檢測禽流感、新城疫血凝試驗檢測，彌補現階段使用的常規方式存在的一些不足。在試驗開始之前需要明確禽流感、新城疫的血凝效價，分別確定為9log2、10log2。以《禽流感、新城疫4HAU抗原配制表》作為參照標準觀察紅細胞凝集孔數量。計算得到禽流感、新城疫的血凝效價以后開始回歸檢測，分別制備體積分數1%的雞紅細胞懸液、體積分數為0.75%的雞醛化紅細胞懸液。隨后使用禽流感病毒抗原是禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗抗原與禽流感4HAU抗原血凝效價為9log2，充分混合均勻后，觀察實際的紅細胞集孔數量。經過計算，最終得出禽流感病毒H7N9（RE-2株）血凝抑制試驗抗原最終的血凝效價為8log2。