具有酪氨酸酶抑制作用的豌豆多肽酶解工藝研究

徐梅 趙大洲 王常青 曹秀娟

1（廈門元之道生物科技有限公司，福建廈門 361100）

2（山西大學(xué)，山西太原 030006）

人體皮膚顏色主要取決于黑色素的分布及含量，而黑色素的形成受到機體內(nèi)酪氨酸酶的控制，該酶的活性與含量影響皮膚黑色素的生成和顏色，同時也對皮膚有一定的保護作用。如果酪氨酸酶活性過高，會使皮膚顏色變深，從而影響美觀，長久還可能產(chǎn)生老年斑和黃褐斑，因此，通過抑制酪氨酸酶活性達(dá)到皮膚美白效果的研究成為當(dāng)前皮膚美容的熱點之一。近十多年來，天然蛋白水解多肽的美容作用越來越受到人們的重視，如膠原多肽、酵母多肽、沙棘多肽與核桃肽等。本文研究了不同蛋白酶水解豌豆蛋白產(chǎn)生的多肽水解物對酪氨酸酶抑制率的影響，并篩選確定了抑制活性和多肽得率都較高的豌豆蛋白酶解工藝，為功能性豌豆多肽的加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆分離蛋白，山東金都塔林食品有限公司；酸性蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶，廣西龐博生物科技有限公司；Neutrase0.8 L 中性蛋白酶，諾維信酶制劑中國有限公司；ProteAX 中性蛋白酶、NY50中性蛋白酶和2SD 中性蛋白酶，阿瑪諾天野酶制劑有限公司；酪氨酸酶，Sigma 公司；其他試劑均為分析純。

UV-2600 紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）有限公司；高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；超濾-納濾膜組件，中科瑞陽膜技術(shù)（北京）有限公司；真空濃縮器，上海華良科學(xué)儀器廠；全自動定氮儀，上海寶英光電科技有限公司；L-3 凝膠色譜儀，上海金達(dá)儀器有限公司；其他均為常規(guī)儀器。

1.2 試驗方法

1.2.1 酸性蛋白酶水解豌豆蛋白的工藝研究

豌豆蛋白粉與純水按1∶20混合浸泡過夜，用酸調(diào)pH 值至3.0，再按原料蛋白質(zhì)量加入酸性蛋白酶進行第一次水解，確定蛋白酶水解豌豆多肽的最適工藝。

1.2.1.1 酶解溫度單因素試驗

在加酶量5 000 U/g，水解時間2 h 條件下，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃溫度下水解豌豆蛋白，所得水解液經(jīng)加熱滅酶和離心后，取上清液測定多肽含量和得率；調(diào)整多肽含量為15 mg/mL，測定并計算酪氨酸酶抑制率。

1.2.1.2 酶解時間單因素試驗

在酶解溫度50 ℃，加酶量5 000 U/g 的條件下，分別水解豌豆蛋白30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min，所得水解液經(jīng)滅酶和離心后，取上清液測定多肽含量和得率；調(diào)整多肽含量為15 mg/mL，測定并計算酪氨酸酶抑制率。

1.2.1.3 加酶量單因素試驗

分別添加酸性蛋白酶2 000 U/g、3 000 U/g、4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g，在50 ℃水解豌豆蛋白2 h，所得水解液經(jīng)滅酶和離心后，取上清液測定多肽含量和得率；調(diào)整多肽含量15 mg/mL，測定并計算酪氨酸酶抑制率。

1.2.2 不同中性蛋白酶二次水解豌豆多肽的研究

由于酸性蛋白酶一次水解的多肽得率較低，為了提高多肽得率，需進行二次水解，考察不同中性蛋白酶的水解效果。取5 份等質(zhì)量的酸性蛋白酶水解滅酶液（多肽得率和酪氨酸酶抑制率為21.70%和48.61%），分別加入枯草桿菌中性蛋白酶、ProteAX蛋白酶、NY50 蛋白酶、2SD 蛋白酶和Neutrase0.8 L蛋白酶，加酶量為5 000 U/g，調(diào)節(jié)水解液pH值7.0，50 ℃水解60 min，取樣、滅酶、離心后，檢測并計算多肽得率和酪氨酸酶抑制率。繼續(xù)水解至120 min，將二次酶水解液加熱滅酶，離心去除沉淀，檢測并計算多肽得率和酪氨酸酶抑制率，確定水解效果最佳的中性蛋白酶。

1.2.3 抑制酪氨酸酶活性多肽分子段的篩選

將采用最佳中性蛋白酶二次水解得到的離心上清液分別用截留分子量為10 kDa、4 kDa、2 kDa 和1 kDa的超濾膜和300 Da的納濾膜分離，得到5個分子量組分4 kDa～10 kDa、2 kDa～4 kDa、1 kDa～2 kDa、300 Da～4 kDa、＜1 kDa。將5 段多肽分離液多肽含量調(diào)整到15 mg/mL，測定各樣品的酪氨酸酶抑制率和肽段占比，確定最佳活性分子段。

1.2.4 豌豆多肽質(zhì)量濃度與抑制酪氨酸酶活性關(guān)系的研究

將300 Da～4 kDa的多肽濾液濃縮后，分別配制成多肽含量5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL 的溶液，測定不同多肽質(zhì)量濃度的酪氨酸酶抑制率。

1.2.5 粗蛋白測定方法

按GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》規(guī)定的方法測定。

1.2.6 多肽含量測定方法

按GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中附錄B 的方法測定。

1.2.7 多肽得率計算方法

計算公式為Q=（S×T×100%）/W，

式中：S—水解液（離心或超濾）中多肽含量，g/mL；

T—水解液體積，mL；

W—水解原料液中粗蛋白質(zhì)量，g。

1.2.8 酪氨酸酶活抑制率的測定與計算

以0.5 mmol/L L-多巴（左旋多巴）溶液為底物，以曲酸為對照品，按表1 進行試驗，混勻后在37 ℃水浴保溫10 min，檢測波長475 nm。A（抑制率）=［1-（A1-A2）/（A3-A4）］×100。

表1 酪氨酸酶抑制率試驗

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性蛋白酶水解豌豆蛋白最佳工藝的確定

2.1.1 酶解溫度對豌豆蛋白水解效果的影響

酶解溫度對豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影響如圖1所示。

圖1 不同酥解溫度的多肽得率與酪氨酸酶抑制率

由圖1可知，酶解溫度低于60 ℃時對酪氨酸酶抑制率沒有明顯影響。酶解溫度在50 ℃時，多肽得率最高，高于60 ℃時多肽得率快速下降，低于40 ℃時多肽得率較低，可能是溫度過高時造成酶變性，溫度過低時蛋白酶活力下降。因此，選擇適宜的酶解溫度為40 ℃～60 ℃。

2.1.2 酶解時間對豌豆蛋白水解效果的影響

酶解時間對豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影響如圖2 所示。

圖2 不同水解時間的多肽得率與酪氨酸酶抑制率

由圖2 可知，當(dāng)酶解時間為30 min～150 min，所得水解液對酪氨酸酶抑制率穩(wěn)定，無明顯變化，超過150 min 水解酪氨酸酶抑制率呈下降趨勢，可能是隨著反應(yīng)時間的延長，酪蛋白酶抑制多肽的干擾物質(zhì)增多所致。多肽得率在酶解90 min～120 min時較高。綜合考慮酪蛋白酶抑制率和多肽得率兩方面要求，酶解時間控制在90 min～120 min較為適宜。

2.1.3 加酶量對豌豆蛋白水解效果的影響

加酶量對豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影響如圖3所示。

圖3 不同加酶量水解的多肽得率與酪氨酸酶抑制率

由圖3 可知，加酶量在3 000 U/g～6 000 U/g 范圍時，多肽的酪氨酸酶抑制率較穩(wěn)定，無明顯變化；加酶量低于3 000 U/g或高于6 000 U/g時酪氨酸酶抑制率呈下降趨勢，原因尚不清楚。多肽得率在加酶量5 000 U/g～6 000 U/g時較高。

2.2 中性蛋白酶二次水解豌豆多肽效果分析

不同中性蛋白酶二次水解效果見下頁表2。由表2數(shù)據(jù)分析可知，先用酸性蛋白酶水解豌豆蛋白，再用NY50C中性蛋白酶二次酶解，酶解60 min時的酪氨酸酶抑制率和多肽得率比僅用酸性蛋白酶水解增高了58.67%和103.96%，經(jīng)濟可行性和性價比明顯提高。用AX中性蛋白酶、0.8L中性蛋白酶和2SD中性蛋白酶二次水解豌豆多肽液均喪失了酪氨酸酶抑制活性，且多肽得率均明顯低于NY50C中性蛋白酶。枯草桿菌中性蛋白酶二次水解多肽2 h 后，盡管多肽得率與NY50C中性蛋白酶相近，但是酪氨酸酶抑制率大幅下降，相比NY50C中性蛋白酶二次水解下降65.13%。因此，酸性蛋白酶解后，再用NY50C 中性蛋白酶二次酶解豌豆蛋白和多肽，多肽得率和酪氨酸酶抑制率分別達(dá)到47.90%和77.58%，此條件為最佳工藝組合。

表2 不同中性蛋白酶二次水解液的工藝參數(shù)比較

2.3 活性多肽分子段篩選結(jié)果

將經(jīng)過膜分離的多肽液中多肽含量調(diào)整到15 mg/mL，分別測定各分子段多肽液的酪氨酸酶抑制率，然后用凝膠層析分析各分子段溶液中多肽含量與總多肽含量的百分比，結(jié)果見表3。由表3 可知，1 kDa～2 kDa 多肽的酪氨酸酶抑制率最佳，達(dá)到74.8%，2 kDa～4 kDa 和＜1 kDa 的多肽均有一定的抑制活性；而300 Da～4 kDa 分子段多肽占總多肽的92.34%，且酪氨酸酶抑制率能達(dá)到66.82%，因此這段多肽的性價比最高，可作為目標(biāo)產(chǎn)品。將300 Da～4 kDa 水解液濃縮并噴霧干燥成粉狀后，再配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的多肽溶液，測得酪氨酸酶抑制率為53.24%，比未加熱濃縮的豌豆多肽抑制率減少了13.58%，下降率為20.32%，說明加熱濃縮過程中可能會使多肽產(chǎn)生一定的聚合，使酪氨酸酶抑制活性下降。

表3 各段多肽的含量分布和酪氨酸酶活性抑制率

2.4 抑制酪氨酸酶活性的豌豆多肽質(zhì)量濃度范圍分析

多肽質(zhì)量濃度與酪氨酸酶抑制率關(guān)系見圖4。

圖4 多肽質(zhì)量濃度與酪氨酸酶抑制度關(guān)系曲線

從圖4 可以看出，多肽質(zhì)量濃度在5 mg/mL～25 mg/mL 范圍內(nèi)，酪氨酸酶抑制率與多肽質(zhì)量濃度呈線性上升關(guān)系；超過25 mg/mL時，酪氨酸酶抑制率上升緩慢，因此，豌豆多肽的最佳作用質(zhì)量濃度范圍為5 mg/mL～25 mg/mL。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，酸性蛋白酶一次水解豌豆多肽的適宜溫度、時間和加酶量分別為：40 ℃～60 ℃、90 min～120 min 和5 000 μg-6 000 μg，豌豆蛋白和多肽二次水解的最佳用酶是NY50 中性蛋白酶。經(jīng)過二次酶解，多肽得率和酪氨酸酶抑制率可達(dá)到47%和77%以上；膜分離得到的300 Da～4 KDa多肽的酪氨酸酶抑制率與多肽得率綜合性價比最高，多肽質(zhì)量濃度在5 mg/mL～25 mg/mL范圍時，酪氨酸酶抑制率與多肽質(zhì)量濃度呈量效關(guān)系。

豌豆蛋白粉是加工豌豆淀粉和豌豆粉絲產(chǎn)生的副產(chǎn)物，該蛋白粉在國內(nèi)的深加工產(chǎn)品很少，本研究利用豌豆蛋白粉加工得到豌豆多肽，在多肽含量1.5%時酪氨酸酶抑制率為70%左右，具有良好的應(yīng)用前景。