紫貽貝粗多糖免疫活性研究

韓瑩 曲有樂

1（山西藥科職業學院，山西太原 030000）

2（浙江海洋大學，浙江舟山 316000）

將紫貽貝粗多糖以不同劑量濃度給小鼠灌胃，以環磷酰胺模型組和正常組小鼠為對照，比較不同組間小鼠的免疫器官重量、小鼠血常規、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α 的差別，分析紫貽貝多糖對不同免疫因子的影響。

1 材料和設備

1.1 材料

Balb/c 小鼠，體重在18 g～22 g，雄性，購于浙江省醫學科學院。飼養條件：25 ℃左右，每12 h晝夜間斷性照明。

紫貽貝粗多糖，由本課題組提取，除去蛋白總糖含量為62.8%。

1.2 試劑

環磷酰胺、白細胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒、白細胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒、白細胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

BT125D 電子天平，塞利多斯科學儀器有限公司；THERMO酶標儀，上海輔澤商貿有限公司。

2 試驗方法

2.1 免疫抑制模型的建立

2.1.1 小鼠分組

將Balb/c 小鼠在清潔安靜溫度適宜的動物房適應性飼養3 天后取50 只，雄性，體重在18 g～22 g，隨機分成5 組，每組10 只，即為空白對照組、紫貽貝粗多糖低劑量、紫貽貝粗多糖中劑量、紫貽貝粗多糖高劑量和環磷酰胺模型。

2.1.2 給藥方法

用左手抓緊小鼠背部和頭部的皮毛，使其固定，并使其頭部后仰，與身體成水平直線，將針頭自口腔右側沿上顎垂直緩慢下行，灌藥0.2 mL，觀察小鼠呼吸正常與否。

2.1.3 造模

空白組小鼠每只每天注射0.2 mL 0.9%的生理鹽水，模型組小鼠前11 天每天每只注射0.2 mL 0.9%生理鹽水。低劑量多糖組每天注射125 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液，中劑量組多糖組每天注射250 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液，高劑量多糖組每天注射500 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液。第12 天，采用皮下注射方式，給多糖組和模型組每只小鼠每天注射0.1 mL 50 mg/kg的環磷酰胺，連續注射3天。

2.2 紫貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠血液中白細胞數的影響

2.2.1 采血

采血前12 h 禁食，采血1 h 前禁水，每組任意選3 只小鼠采血，選用眼球摘除采血法采血。摘除小鼠眼球后，小鼠血液應立即放入抗凝管中，混勻后，4 h內完成檢測。

2.2.2 血樣檢測

選用血液自動分析儀對小鼠血液樣本進行檢測。每組任意選3只小鼠的血液樣本做重復性試驗。

2.3 紫貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

2.3.1 采血

在解剖前一晚斷糧，不斷水。第2 天，稱重，活體摘除眼球取血，每只取1 mL，在4 ℃冰箱低溫保存，靜置24 h，4 000 r/min 離心10 min，收集血清。放于-20 ℃冰箱備用。

2.3.2 小鼠血清的IL-2、IL-4、IL-10 和TNF-α 檢測方法

試驗前將小鼠血清和試劑盒取出解凍，溫度恢復至室溫。加入1 mL 標準品稀釋液至凍干標準品中，待完成溶解后，靜置15 min 混勻，之后按1 000μL、500μL、250μL、125μL、62.5μL、31.25μL、15.625μL 進行稀釋。根據待測樣品數量和標準品數量決定所需的板條數，并增加1 孔作為空白對照孔。將標準品對應放入孔中，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃烘箱孵育90 h。加入相應試劑，于450 nm處測吸光度值。

2.4 數據分析

用SPSS17.0進行統計分析，結果用()x±s表示。當P＜0.05，統計學顯著，當P＜0.01，統計學極顯著；P＞0.05，組間差異無統計學意義。

3 結果與討論

3.1 對免疫抑制小鼠血液中白細胞數的影響

通過血液檢測，對正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環磷酰胺模型組小鼠血液中血紅蛋白數進行分析比較，測定結果如圖1所示。

圖1 紫貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠白細胞數量的影響

免疫抑制造模后，環磷酰胺模型組白細胞數量顯著小于正常組。低劑量組與中劑量組小鼠白細胞數量比環磷酰胺模型組多，但均無統計學意義。與模型組相比，高劑量組可大大促進小鼠白細胞的產生；與正常組相比，高劑量組小鼠白細胞雖比正常組多，但無統計學意義。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統計學意義。

結果表明，紫貽貝粗多糖可刺激小鼠血液中白細胞的產生，對小鼠的免疫調節作用明顯。紫貽貝粗多糖含量越高，免疫調節作用越好，但低劑量、中劑量多糖對免疫調節的作用有限。

3.2 對小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10 和TNF-α 的影響

3.2.1 給藥14天小鼠血清IL-2的水平變化

3.2.1.1 IL-2標準曲線的制定

標準品按原液1∶2∶4∶8∶16∶32 比例用50μL、100μL 微量加樣器加入標準品稀釋液，空白孔加入50μL原始濃度空白對照液，以IL-2標準溶液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線（圖略）。得出線性方程為y=0.004x+0.018，R2=0.993 4。

3.2.1.2 小鼠血清IL-2的水平變化

采用白細胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒對正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環磷酰胺模型組小鼠血清中IL-2含量進行分析比較，測定結果見圖2。

圖2 紫貽貝多糖對小鼠血清IL-2水平的影響

免疫抑制造模后，環磷酰胺模型組血清IL-2含量顯著低于正常組。低劑量組比模型組高，但無統計學意義。中劑量和高劑量組與模型組相比，均可大大增加小鼠血清中IL-2含量。高劑量組與正常組相比，含量大于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統計學意義。由圖2 可以看出，小鼠血清IL-2水平隨著粗多糖含量的增高而增高，且中劑量和高劑量組小鼠血清IL-2水平高于正常組。而只注射環磷酰胺的模型組明顯低于正常組和多糖組。

結果表明，低劑量粗多糖對免疫調節的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 可明顯提高小鼠血清IL-2含量，提高小鼠免疫力，且紫貽貝粗多糖調節作用與多糖含量成正比。

3.2.2 給藥14天小鼠血清IL-4的水平變化

3.2.2.1 IL-4標準曲線的制定

IL-4 標準曲線的制定同3.2.1.1，根據測定結果得出標準曲線的線性方程為y=0.002x+0.078 6，R2=0.999 4。

3.2.2.2 小鼠血清IL-4的水平變化

采用白細胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒對正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環磷酰胺模型組小鼠血清中IL-4 含量進行分析比較，測定結果見圖3。

圖3 紫貽貝多糖對小鼠血清IL-4水平的影響

免疫抑制造模后，環磷酰胺模型組血清IL-4含量顯著低于正常組。低劑量組小鼠血清IL-4比模型組高，但無統計學意義。與模型組相比，中劑量和高劑量紫貽貝粗多糖可大大增加小鼠血清IL-4 含量。高劑量組與模型組和正常組相比，小鼠血清IL-4 含量大于正常組和模型組。低劑量組與中劑量組和高劑量組相比含量極其顯著低，有統計學意義。由圖3 可以看出，小鼠血清IL-4 水平隨著粗多糖含量的增高而增高，且中劑量和高劑量組小鼠血清IL-4水平高于正常組，而只注射環磷酰胺的模型組明顯低于正常組和粗多糖組。

結果表明，低劑量粗多糖對免疫調節的作用有限。紫貽貝粗多糖為250 mg/kg 和500 mg/kg 時可明顯提高小鼠血清IL-4含量，具有提高小鼠免疫力的作用，且調節作用與粗多糖含量成正比。

3.2.3 給藥14天小鼠血清IL-10的水平變化

3.2.3.1 IL-10標準曲線的制定

IL-10標準線曲線的制定同3.2.1.1，根據測定結果得出標準曲線線性方程為y=0.003 4x+0.039 4，R2=0.999 4。

3.2.3.2 小鼠血清IL-10的水平變化

采用白細胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒對正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環磷酰胺模型組小鼠血清中IL-10 含量進行分析比較，測定結果如圖4所示。

免疫抑制造模后，環磷酰胺模型組血清IL-10含量顯著低于正常組和粗多糖組。低劑量組小鼠血清IL-10 含量顯著比模型組高。中劑量組和高劑量組與模型組相比，均可大大增加小鼠血清IL-10 的含量。高劑量多糖組小鼠血清IL-10 含量大于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統計學意義。由圖4 可以看出，小鼠血清IL-10水平隨著粗多糖含量的增高而增高，而只注射環磷酰胺的模型組，小鼠血清IL-10 水平明顯低于正常組和粗多糖組。

圖4 紫貽貝多糖對小鼠血清IL-10水平的影響

結果表明，低劑量多糖對免疫調節的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 濃度下可明顯提高小鼠血清IL-10 含量，具有提高小鼠免疫力的作用，且調節作用與粗多糖含量成正比。

3.2.4 給藥14天小鼠血清TNF-α的水平變化

3.2.4.1 TNF-α標準曲線的制定

TNF-α 標準線曲線的制定同3.2.1.1，根據測定結果得出標準曲線的線性方程為y=0.004x+0.018，R2=0.993 4。

3.2.4.2 小鼠血清TNF-α的水平變化

采用腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒對正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環磷酰胺模型組小鼠血清中TNF-α含量進行分析比較，測定結果如圖5所示。

免疫抑制造模后，模型組血清TNF-α 含量顯著低于正常組。低劑量組小鼠血清TNF-α 含量顯著比模型組高。與模型組相比，中劑量和高劑量組可大大增加小鼠血清TNF-α 含量。高劑量組與正常組相比，高劑量粗多糖組小鼠血清TNF-α 含量高于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統計學意義。

由圖5 可以看出，小鼠血清TNF-α 水平隨著粗多糖含量的增高而增高，而只注射環磷酰胺的模型組，小鼠血清TNF-α 水平明顯低于正常組和粗多糖組。

圖5 紫貽貝多糖對小鼠血清TNF-α水平的影響

結果表明，低劑量多糖對免疫調節的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 時可明顯提高小鼠免疫力的作用，紫貽貝粗多糖調節作用與粗多糖含量成正比。

4 結論

白細胞是具有防御和免疫功能的無色有核球形細胞，免疫低下造模對小鼠血液中的白細胞影響顯著，也會影響小鼠自身的防御和免疫功能。IL-2 最重要的作用是誘導T 淋細胞的分化，從而達到免疫調節作用。IL-4 可增強B 細胞抗原提呈能力，使免疫系統對小量抗原刺激發生免疫應答。IL-10 可促進肥大細胞和胸腺細胞增殖，IL-10 也是淋巴結、脾臟細胞生長的復合因子，從而提高發揮免疫抑制或免疫刺激作用。TNF-α 可以增強IL-2 依賴的胸腺細胞、T細胞增殖能力，從而起到免疫抑制作用。由試驗結果可知，中高劑量粗多糖可增加免疫抑制小鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α 含量。紫貽貝多糖對小鼠的具有免疫調節作用，且紫貽貝粗多糖的免疫調節力隨著粗多糖含量的增加而增加。綜上所述，紫貽貝粗多糖對免疫抑制小鼠具有免疫調節作用，粗多糖含量越高，免疫調節作用越好。