PCR技術在食品微生物檢測中的應用

◎ 周振杰

（甘肅省莊浪縣市場監督管理局（甘肅省莊浪縣食品藥品稽查局）,甘肅 莊浪 744699）

在食品微生物檢測工作中采用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術時，應形成正確的技術應用認知，制定完善的技術方案，通過有效的措施提高食品微生物檢測工作的效率，發揮現代化技術的作用，確保能及時發現食品微生物問題，并有效解決和應對，為保證食品質量、維護人們的身體健康和生命安全夯實基礎。

1 PCR技術在食品微生物檢測中的應用

1.1 大腸桿菌的準確檢測

傳統的食品微生物檢測技術能對大腸桿菌進行檢測，但檢測范圍狹窄，而采用PCR技術能在檢測常規大腸桿菌的基礎上，準確檢測出引起人們腸出血的大腸桿菌類別，為食品質量和安全管理提供一定的保障。

1.2 沙門氏菌的有效檢測

沙門氏菌具有一定的傳染性，且對人體的危害非常嚴重，甚至有致死性的危害，因此對其進行有效檢測非常重要。而多重類型的PCR技術在應用過程中，可確保檢測結果的精確度和精準性，增強整體檢測工作的有效性和可靠性。

1.3 非致病菌的合理檢測

非致病菌主要涉及乳酸菌，是在自然界廣泛存在且具有一定學術研究價值的菌類，與人們的日常生活、生產、食品和醫療等有密切關聯。采用PCR技術開展乳酸菌的檢測工作，不僅能準確歸納分析其具體規律，還能提升整體檢測工作的效率和效果。

此外，在食品檢測過程中采用先進的PCR技術，還能提升各項檢測工作的便利性、改善目前的工作現狀、增強檢測工作的精確性和科學性，在滿足衛生檢測工作標準的同時，還能促使食品安全管理工作的有效落實和全面開展。

2 PCR技術分析

2.1 常規PCR技術

常規的PCR技術在實際應用的過程中，主要是設置DNA模板和引物，制備緩沖液材料和MgCl2溶液，將各類材料有機整合成為反應混合物，通過熱穩定DNA聚合酶進行催化處理，對寡核苷酸引物界定出來的DNA片段進行擴增處理。此類擴增操作是將模板DNA作為基礎部分，進行引物的變性反應、退火反應和延伸反應。在循環操作的情況下，使目標DNA片段出現擴增的現象。通常情況下，各個反應周期出現的DNA片段都可作為下個循環的模板，所以PCR技術在應用期間所產生的產物是以指數形式增加。例如，在食品微生物檢測過程中使用常規PCR技術，可有效檢測沙門氏菌，按照沙門氏菌基因設置引物，可有效檢測沙門氏菌、多種血清型與菌屬的非沙門氏菌，檢測的準確性較高。

2.2 多重PCR技術

多重PCR技術在實際應用過程中和常規技術的應用原理相同，不同之處是在相同反應體系內設置一對或以上的特異類型引物，構建和各個引物特異性進行互補的模板，即可在相同反應管內擴增多條目標DNA片段。此技術不僅能保留常規技術的特異性和敏感性優勢，還能簡化檢測工作的步驟、減少試劑的使用劑量、一次性同時擴增多種需要檢測的微生物，因此在食品微生物檢測期間采用多重PCR技術，能同時檢測多種微生物基因，減少工作人員的工作量。但是，多重PCR技術在應用過程中存在不足之處，如擴增處理的效率較低、缺乏一定的敏感性。在擴增過程中需要摸索反應條件，可能會發生不同引物之間相互干擾的問題，因此需要結合具體情況探索多重PCR技術的應用措施和方法。例如，在食品中大腸菌群的檢測過程中采用多重PCR技術，可利用點對點的方式設置固定性多聚dT尾捕捉探針，配合使用生物素進行擴增DNA標記處理，達到準確檢測食品微生物的目的。

2.3 RT-PCR技術

逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術的原理是提取食品組織，或提取食品細胞內的總RNA，將其中所存在的mRNA作為模板，利用dT或隨機引物，借助逆轉錄酶將提取的物質轉錄成為cDNA，再將其作為模板實現PCR擴增的目的，明確目標檢測基因的情況。在食品微生物檢測過程中采用此技術能提升RNA檢測的靈敏度，甚至能提升多個數量級，準確分析微量RNA樣本。例如，在食品微生物檢測的過程中可通過RTPCR技術進行大腸桿菌噬菌體的檢測分析，將F-RNA平板作為陽性結果數據值的依據，在SC（Somatic Coliphage）噬菌體和F-RNA（F-specific RNA）噬菌體混合液內，可準確、有效檢測F-RNA噬菌體[1]。

2.4 免疫PCR技術

免疫PCR技術是將DNA分子作為主要標記物，在進行一般免疫反應的基礎上，還可有效完成PCR擴增操作、電泳分析操作，整體的免疫試驗效果較高。在食品微生物檢測過程中采用免疫PCR技術，可提升系統的擴增性能，改善抗原抗體反應的特異性，最大程度地增強檢測抗原應用的靈敏度，且由于所有DNA分子都屬于可選擇性的固定分子，合成一對引物即可完成操作，可避免在更換檢測對象過程中還需更換引物的問題，簡化了操作流程和操作模式。免疫PCR檢測技術的應用，通常可將生物素當作連接分子，而生物素在應用過程中具備獨立性的結合點位，其中一個點位能和DNA分子結合，另外一個點位能和抗原-抗體復合物中的親和素之間相互結合，使DNA分子與抗原-抗體親和素相互整合，最終生成抗原、抗體、親和素、生物素和DNA之間相互融合的復合物，再進行PCR擴增處理，對DNA進行合理地標記即可。

2.5 巢式PCR技術

巢式PCR技術需構建兩套引物達到PCR擴增處理的目的，通過內部和外部兩對引物前后進行靶基因片段的擴增處理，先使用其中一套引物擴增20個左右的循環，再利用已經完成擴增的DNA片段，進入另外一套引物的擴增循環，循環20個左右。在此期間第二套引物的設計片段位置是在第一套引物的擴增片段內，因此可將第一套引物稱作外引物，第二套引物稱作內引物。此外，巢式PCR技術的應用不僅能提升整體反應的特異性，還能獲得非常豐富的特異靶序列，提高整體檢測的敏感度，在食品微生物檢測的過程中，能有效進行基因靶DNA的單拷貝擴增處理，提升整體檢測效率和準確性[2]。

采用巢式PCR技術可在首次擴增反應完成后開啟反應管，去除前一套引物，再設置另一套引物，整個操作流程較為煩瑣，很容易出現反應系統污染的問題，所以目前部分技術人員在食品微生物檢測過程中對巢式PCR技術進行了改進，通過引物的改進使外引物退火溫度比內引物高，從最開始的反應階段就將兩套引物同時設置在反應系統內，外引物在退火溫度的影響下形成雙溫循環擴增，而內引物不能和模板之間形成較為穩定的雙鏈，所以不會起到相應的作用。在外引物擴增反應完成后，再設置低火溫的循環處理，在退火溫度較低的情況下，內引物開始發生反應，多次循環逐漸減小變性溫度，這樣能預防在整體反應過程中PCR最開始的循環出現原始樣本模板序列產物解鏈的問題，以免內引物成為外引物的模板，增強檢測效果的同時彌補了常規技術的不足，提升食品微生物檢測工作的質量和水平[3]。

3 PCR技術在食品微生物檢測中應用的基礎保障

3.1 合理選擇儀器設備

在進行食品微生物檢測前，應結合PCR技術的應用特點和情況，科學選擇儀器設備，確保所選用的儀器設備可進行食品微生物的快速檢測，精確檢驗菌落的總體數量，精確度控制在合理范圍內，重復性維持在5%以內，同時還需結合食品的特點進行檢測儀器設備的選擇。例如，牛奶、面包、豆漿和果汁等可采用微生物分子檢測儀設備；食品中的沙門氏菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌等檢測可采用多孔板儀器設備進行多次試驗分析。同時，在應用該技術過程中還可構建多重串聯類型的實時性熒光定量檢測設備，如聯合使用試驗試劑盒、冰箱、滅菌器、梯度儀和核酸電泳儀等，并且在全封閉的環境下檢測，避免發生檢測結果假陽性或假陰性的問題，提升整體檢測分析的精確度[4]。

3.2 合理選擇試驗方法

食品微生物檢測的過程中采用PCR技術，應重點選擇合理的試驗檢測的方法，確保檢測工作的有效開展。例如，采用PCR技術檢測肉制品中的微生物，可分為以下步驟。①取食品樣本，放入蒸餾水中，加熱攪拌后使樣本溶解，再在高溫、高壓的環境中進行滅菌。②使用滅菌純水稀釋試驗材料，放置在規定的溫度環境中保存，將硼酸等物質放置在蒸餾水內，調整pH值，確保pH值在穩定的范圍內，然后在高壓滅菌室內存儲。③制作瓊脂糖凝膠。稱取數量符合規定標準的瓊脂糖，加入反應材料，通過微波爐加熱處理，等待所有瓊脂糖溶解后，注入模具內進行冷卻。再稱取一定數量的瓊脂糖，在蒸餾水中溶解，嚴格控制蒸餾水的含量，放置在高溫環境中進行滅菌處理，滅菌操作時間符合標準規范。④構建完善的PCR檢測體系，對檢測靶基因擴增處理，將需要檢測的目標菌種制作成模板，混合溶液內存在的多種菌種，形成多重性的PCR反應程序和體系，結合檢測結果進行標準曲線的繪制，獲得相應的擴增效率指標。再按照稀釋倍數的特點和情況，明確菌落計算數據結果，每隔一段時間完成三重PCR檢測的任務，如果變異系數能維持在合理范圍內，則證明使用的檢測措施具備較高的重復性和精確性，能滿足標準要求[5]。

在牛奶中沙門氏菌含量的測定過程中，采用PCR模板制備技術開展靈敏度試驗，檢測樣本中沙門氏菌的敏感性情況。①合理選擇樣本，科學開展純菌培養操作，將牛奶食品樣本放入高壓蒸汽滅菌器內經過處理后，存儲在冰箱內。②對所有試驗菌株進行接種處理，在液體內接種，通過振蕩方式進行液體內菌種的培養，培養溫度和振蕩速度控制在規定范圍內。③采用乙醇沉淀技術進行模板的制備，提取細菌培養液放置在離心機設備中離心處理，合理控制設備轉速，再使用滅菌蒸餾水進行洗滌，通過懸浮液緩沖，在相應的環境中離心處理，隔水煮沸后加入醋酸鈉物質，添加無水乙醇，離心處理后添加緩沖劑進行復溶，通過乙醇洗滌，放置在冰箱內冷卻，完成模板的制作。④將濃度適中的菌液接種在試驗樣本內，提取基因組，擴增后繪制擴增數據值的表格和圖片，根據標準曲線進行樣本中的微生物檢測，明確大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等檢測下限是否符合規定標準要求，如果符合規定就代表食品中微生物含量合格，如果超出規定標準就代表食品中所含微生物超標，存在質量安全問題。

4 結語

綜上所述，食品微生物檢測的過程中PCR技術具有一定應用價值和應用意義，能提升檢測工作效率。因此在實際檢測工作中需結合不同類型的PCR技術特點和情況，有針對性地進行食品微生物的檢測檢驗，提升PCR技術的應用效果，確保能精準、全面、快速、及時檢測食品內的微生物，為有效維護食品質量安全提供幫助。