喙尾琵琶甲有效成分的藥理活性及其作用機理的研究進展

孔彩華，李萬輝，王欽，劉克娜，隋世燕，*

(1.大理大學農學與生物科學學院，云南 大理 671003；2.大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000)

喙尾琵琶甲(Blapsrynchopeterafairmaire)屬于鞘翅目(Coleop-tera)擬步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲屬(Blaps)，為中國西南地區(云貴高原)的一種攜帶臭味的昆蟲，大多分布在云南滇中、滇東高原[1]。當地人稱其為小黑蟲、臭殼殼蟲和打屁蟲等。該蟲開始被命名為日本琵琶甲云南亞種，后來為了方便又被稱為“云南琵琶甲”，2007年經專家鑒定為喙尾琵琶甲[2]。喙尾琵琶甲營養價值很高，含有除色氨酸外的7種人體必需氨基酸，總量達到248 mg/g，此外，蛋白含量為10.12%，脂肪含量為10.51%，具有高蛋白和低脂肪的特點[3]。

喙尾琵琶甲蟲體體內有多種有效活性成分，主要為酚類化合物、環肽和氨基酸類化合物、油脂等，蟲體防御液及甲殼素中也含有有效活性成分[4]。此種昆蟲在云南民間，特別是被云南彝族百姓作為藥物應用較多。當地人將其活體成蟲經飲用酒或酒精制成藥酒外敷，以驅除瘡中毒素及水泡引起的痛癢，還用該蟲治療疔瘡、皮膚癢痛、皰疹、腰酸背痛、腰椎間盤突出等，效果顯著；蘸取蟲體粉碎物于牙齒蛀洞內或開水口服，可治療牙痛、齲齒痛，還可以治療感冒引起的發燒[2]。此外，與黑骨頭、石巖菜、重樓等一起用水煎服可治療小兒麻痹；與鮮嫩木賊研碎后和鮮雞脯爆炒與稀飯共服，對晚期肝癌患者有顯著效果；放入雞蛋蒸熟后一起食用可以治療乳腺癌；而與金果攬、壁虎研碎開水送服以治療食道癌等[2]。

喙尾琵琶甲在治療各種疾病疼痛中表現出顯著的藥理作用，具有較大的藥用價值和潛在的開發利用前景。但是，其發揮藥理作用的具體有效成分仍然不清楚，作用機理有待深入研究。本文就喙尾琵琶甲不同溶劑萃取所含活性成分、藥理活性及其作用機制進行綜述，并分析總結，旨在為將來對該藥用昆蟲進行深入研究和開發利用提供理論基礎。

1 藥理活性

1.1 抗菌、抑菌活性

施貴榮等[5]先后研究了喙尾琵琶甲乙醇提取后不同極性溶劑萃取以及石油醚脫脂后甲醇和水提取物的抗菌活性。結果發現，其乙醇提取物對引起化膿性疾病的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，甲醇提取物及水提物對金黃色、白色葡萄球菌均具有較強的抑制作用，但對痢疾桿菌效果不顯著，甲醇提取物的抗菌作用高于水提物；另外，乙酸乙酯和丙酮萃取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑制效果，但前者高于后者，并且前者對白色葡萄球菌的抑制作用最強。

研究發現，喙尾琵琶甲幼蟲全蟲勻漿無抑菌作用，但通過0.1%三氟乙酸提取，凝膠色譜分離純化得到的抗菌肽(分子量約20 kD)具有顯著的抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的活性[6]。在上述研究的基礎上，將喙尾琵琶甲幼蟲(8～11日齡)用50 ℃熱水處死干燥，粉末分別用石油醚和乙酸乙酯浸泡，然后采用硅膠柱和凝膠柱色譜提取脂溶性物質,結果發現，石油醚提取物無抑菌活性，而乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌具有顯著的抑制效果[7]，進一步印證了喙尾琵琶甲對革蘭氏陽性菌的抑制效果更佳，其抑菌活性物質是極性較大的脂溶性小分子。

以二氯甲烷為萃取劑萃取喙尾琵琶甲的防御液，其中最主要的成分是苯醌類、苯酚類、烷類以及胺類，它們都具有較好的抑制枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠桿菌的效果[8]。其中的苯醌能夠與細菌細胞內的DNA和蛋白質相互作用形成共價復合物，同時產生活性氧，造成其基因突變和蛋白質變性，最終導致細胞死亡[9]。郭明磊等[8]使用喙尾琵琶甲防御液(臀腺分泌物)研究對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、革蘭陰性菌大腸桿菌和銅綠桿菌的抑菌效果，結果發現，加入二氯甲烷分層后的下層有機相對4種細菌均具有較好的抑制作用，但對革蘭氏陽性菌的抑制效果更好，并且對枯草桿菌的抑制效果最好。

1.2 鎮痛、抗炎活性

喙尾琵琶甲鮮蟲用95%乙醇浸泡后減壓濃縮為浸膏(收縮率為20%～25%)，使用熱板致痛法和小鼠扭體實驗分別研究浸膏的神經鎮痛和外周鎮痛效果,使用小鼠耳廓腫脹法測定其抗炎效果,結果發現，高劑量(0.4 g/mL)的浸膏能較好地抑制熱板疼痛，而低劑量(0.2 g/mL)就能較好地抑制小鼠扭體反應[10]，表明喙尾琵琶甲乙醇浸膏具有較好的鎮痛作用，特別是對外周性疼痛效果更佳，但是抗炎效果不明顯。然而，先將活體用95%乙醇浸泡致死，蟲體干燥后粉碎，再用60%乙醇浸泡，合并浸泡液濃縮制成凍干粉，該提取物的抗炎效果則與阿司匹林相近，另外，喙尾琵琶甲乙醇提取物急性毒性很小，小鼠的最大耐受量達500 g/kg，半數致死量無法計算，且進食量和體質量變化各組間均無顯著性差異[11]。說明在正常劑量下該藥的鎮痛和抗炎效果尤佳，無毒副作用。

1.3 抗腫瘤、抗癌活性

有研究發現，喙尾琵琶甲水提物和乙醇粗提物在體外均具有明顯的抑制人卵巢癌細胞Skov3增殖的作用，對人子宮頸癌HeLa細胞無影響，但對正常的細胞株也有損傷作用，并且在體內未發現抑瘤效果[12]。使用改進了的水提緩沖液，使其能夠保留水溶性大分子和熱敏小分子物質，結果則能夠顯著的抑制HeLa細胞的增殖[13]。將喙尾琵琶甲活體用95%乙醇浸泡，再用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取后濃縮，結果發現，乙酸乙酯萃取物能夠顯著地抑制人乳腺癌細胞MD-A-MB-231和SKBR3、人胰腺癌細胞ASPC1、人前列腺癌細胞PC3[12-13]以及人結直腸腺癌細胞CaCO-2和人肺癌細胞A549[14]的增殖，并發現抗腫瘤活性成分為酚類化合物，同時該活性成分還對銅綠假單胞桿菌具有顯著的抑菌活性。其證實了喙尾琵琶甲提取物具有顯著的體外抗腫瘤和抗癌效果，但是，體內效果如何還有待進一步研究。

1.4 抗氧化活性

喙尾琵琶甲鮮蟲、干蟲及分泌液中均含有多酚類物質[15]。而昆蟲體內的多酚類物質具有顯著的抗氧化作用。使用石油醚和乙酸乙酯為萃取劑萃取，發現該蟲乙醇提取物的乙酸乙酯部位是酚類物質的富集部位，并且鮮蟲體內的多酚類成分含量高于干燥蟲體[14，16-17]。

將喙尾琵琶甲用95%乙醇冷浸提取3次，得到的粗提物用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取分離得到一種新的異二聚體，一種新的天然產物和11種已知的酚類化合物，利用DPPH方法研究該萃取物的體外抗氧化活性，結果發現，兩種化合物均具有顯著清除自由基的能力，自由基清除率高達3.52和7.83[16]。肖懷[14]將喙尾琵琶甲成蟲處死，風干，粉碎后經石油醚脫脂后分別用95%、85%及75%乙醇冷浸提取，合并濾液，回收乙醇后分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，共獲得80個化合物，大部分為對苯二酚或鄰苯二酚結構的多酚類物質，同時研究發現，乙酸乙酯部位具有最強的抗氧化能力?？梢姡刮才眉椎捏w外抗氧化成分主要集中在中小極性部分，該蟲乙醇提取物的乙酸乙酯部位的抗氧化活性值得深入研究，但喙尾琵琶甲的體內抗氧化效果還未見報道。

1.5 創傷修復和肝損傷保護

瘢痕是皮膚纖維母細胞增殖與凋亡失衡所致的疾病。趙文斌等[18]首先將云南琵琶甲使用甲醇熱回流、正己烷萃取物(極性小)涂于增生瘢痕患者患處，結果瘢痕增生抑制效果顯著，痛癢癥狀明顯減輕，與藥物治療組相比復發率較低。結果還發現，該提取物對兔耳增生性瘢痕具有顯著的抑制作用。此外，還有研究發現，喙尾琵琶甲乙醇提取物能夠顯著抑制人胚肺二倍體成纖維細胞的增殖，對人肺纖維化的治療具有潛在的效果[19]。另有研究將喙尾琵琶甲用70%乙醇冷浸提取，濃縮制成浸膏，收縮率控制為25%，用白酒灌胃大鼠建立肝損傷模型，結果發現，低、中劑量的該提取物具有顯著的保護酒精性肝損傷作用[20]。

1.6 綜合作用和其他作用

環二肽具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗細菌和神經保護等多種生物活性[21]。喙尾琵琶甲甲醇提物用正丁醇萃取，得到了10個環二肽類物質[22]。對喙尾琵琶甲甲醇熱回流產物的正己烷萃取物分析測定，發現其油脂的主要化學成分為不飽和脂肪酸[23]，這將在心血管疾病防治中發揮顯著效果，還可以增強機體對腫瘤的免疫力。

甲殼素具有良好的成膜、生物降解、可再生等特性，還具有顯著的抗菌、抗癌、抗凝血等藥理作用，但目前主要來源于蟹殼和蝦[24]。有研究通過堿酸法提取到喙尾琵琶甲的甲殼素，使用紅外光譜及X-射線衍生對其進行結構表征，結果與標準品相符，并且發現比從蝦、蟹中提取的效果更好；此外，從體壁角質化程度較高的喙尾琵琶甲中提取的甲殼素得率最高[25]。

Xu等[26]采用氣相色譜-質譜結合方法探究喙尾琵琶甲提取物中抗α-淀粉酶活性成分，發現所鑒定的20種化合物中戊酸具有抑制α-淀粉酶的活性，表明喙尾琵琶甲提取物中的戊酸具有降血糖作用。

將喙尾琵琶甲活體用95%乙醇浸泡致死，蟲體晾干后粉碎再用60%乙醇浸泡，合并浸泡液進行濃縮干燥制成凍干粉，用生理鹽水溶解做成不同濃度藥劑，針對實驗兔的貧血進行治療，及觀察家兔小腸平滑肌的收縮，結果發現該藥劑對實驗兔的貧血有顯著緩解作用，能抑制家兔小腸平滑肌的收縮，且與劑量存在量效關系[27]。可見，該提取物具有顯著的治療貧血和抑制腸痙攣作用，這一結果也為民間使用該蟲酒精浸泡物治療胃腸疾病作出了論證，如抑制胃腸痙攣、緩解腸道疼痛和治療胃炎。

研究還發現，除刺激性分泌物及水部位外，喙尾琵琶甲乙醇提取物及不同極性萃取的氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、精制多糖等均有一定的免疫活性，以精制多糖、氯仿部位、乙酸乙酯部位效果顯著。

2 作用機理

2.1 抑制癌細胞生長

調控細胞凋亡的信號通路主要包括內源性(線粒體)通路、外源性(死亡受體)通路和內質網通路[28]?，F有的研究表明，喙尾琵琶甲主要通過阻滯細胞周期誘導細胞凋亡，為調控細胞凋亡的內源性通路。賡迪等利用流式細胞術，結合MTT結果，發現413 μg/mL云南琵琶甲粗提物顯著提高HeLa細胞S期細胞數，推測藥物可將HeLa細胞阻滯在S期，從而影響了細胞DNA的復制，促使癌細胞凋亡[13]。

14-3-3蛋白參與細胞周期調控、凋亡、增殖等通路，可與靶蛋白相結合起促凋亡和抗凋亡作用[29]。Yan等[30]從日本琵琶甲乙醇提取物中提取到3種新型天然化合物，對它們進行功能研究發現，化合物1和2具有明顯的抑制14-3-3蛋白作用，14-3-3蛋白能結合和調控多種癌基因和抑癌基因，表明喙尾琵琶甲提取物具有顯著的抗癌作用可能以14-3-3蛋白為靶點發揮抗癌作用。

2.2 抑制瘢痕增生

皮膚創傷時傷口內的膠原合成與分解呈動態平衡，該平衡一旦被打破，就會形成膠原沉積導致增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)。趙文斌等[18]對兔建立耳HS模型，術后28 d將模型隨機分為喙尾琵琶甲提取物制劑(云南省中醫醫院制劑中心提供)組、陽性藥物(復方肝素鈉尿囊素凝膠干預)對照組和空白對照組，用RT-PCR方法檢測耳HS組織TGF-β1 mRNA的表達，結果發現與空白對照組相比，實驗組、陽性藥物對照組瘢痕增生指數(HI)、膠原密度、成纖維細胞數量和創傷愈合、瘢痕形成等關鍵轉化生長因子TGF-β1 mRNA表達量均顯著降低或減少，表明該提取物能夠通過下調TGF-β1的表達抑制瘢痕增生。在上述實驗的基礎上，增加模型組(HS模型涂抹生理鹽水)和不同劑量喙尾琵琶甲提取物組，結果發現制劑組HI指數、瘢痕的直徑和厚度均顯著降低，并且顯著抑制增生性瘢痕組織中相關標志物Nanog、Oct4及Hedgehg信號通路相關基因SHH、Patch、Smo、Gli-1的表達水平，此外，2.668g/kg制劑組與15mg/kg劑量復方肝素鈉尿囊素凝膠治療效果相近。體外研究也發現，使用該制劑(0.025、0.05、0.1g/mL)處理表皮干細胞均可以抑制該細胞的增殖，可以降低表皮干細胞中Nanog和Oct4及SHH、Patch、Smo、Gli-1的基因和蛋白表達水平，還可以顯著抑制增生性瘢痕組織相關標志物CD49F、CD29 和CK19 的陽性細胞比率，并且可以減弱增生性瘢痕中表皮干細胞干性[31]。而Hedgehog信號通路在調控組織損傷修復、血管再生等過程中發揮著重要作用。

綜上所述，喙尾琵琶甲對瘢痕增生具有良好的抑制效果，主要通過抑制Hedgehog信號通路進而抑制表皮干細胞干性來治療增生性瘢痕。

2.3 抗炎作用

小腸炎癥等疾病會引起小腸平滑肌組織異常收縮[32]，研究表明，喙尾琵琶甲醇提物可使家兔小腸平滑肌收縮頻率降低、收縮張力降低、收縮曲線與基線間面積減小;研究結果表明，喙尾琵琶甲乙醇提取物對實驗兔的抑制小腸平滑肌收縮的作用機制可能與組胺H1受體有關[27]。Yan等[33-34]證實了日本琵琶甲提取物能抑制環氧化酶COX-2活性，其作用機制可能是通過抑制COX表達而減少前列腺素的合成，從而起到抗炎作用。此外，喙尾琵琶甲乙醇提取物能夠有效地保護和治療角叉菜膠所致大鼠非細菌性前列腺炎，其作用的機理可能是通過抑制炎癥因子的滲透來調節前列腺組織的局部免疫反應[35]。

2.4 抗氧化作用

崔文博等利用DPPH和ABTS方法對喙尾琵琶甲進行體外抗氧化活性研究，結果表明，喙尾琵琶甲的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物部位均有不同程度的自由基清除能力，其中氯仿和乙酸乙酯部位具有較好的抗氧化活性，其抗氧化作用主要通過清除DPPH自由基及ABTS自由基來實現[36]。

對喙尾琵琶甲活性成分作用機制的研究不僅是為探索其如何發揮療效，更為重要的是能夠發現活性成分發揮療效過程中的關鍵作用靶點、作用信號通路及其上下游的關鍵因子，為其藥物的開發和利用提供參考依據。但是，現在國內外對于喙尾琵琶甲活性成分作用機制的研究還很少，也較為膚淺。

4 展望

喙尾琵琶甲具有顯著的抗菌、抗腫瘤、抑制炎癥等藥用效果，還具有一定的營養價值，發展前景廣闊。但目前相關的研究主要集中在其不同提取物在抑菌、抗癌、抗氧化等方面的生理作用研究上，對其具體活性成分是什么，它們如何通過影響細胞內信號轉導通路，進而影響靶因子發揮抗細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和遷移等分子機制尚不明確，分子機理方面的研究十分有限，這將是下一步研究的重點。對喙尾琵琶甲提取物展開更深層次的物質基礎與作用機制研究，將兩者密切聯系，找到藥物核心作用靶點、關鍵信號通路、代謝通路等，進而找到成分明確、機制清楚、藥效可靠的關鍵有效成分或成分群，有助于進一步加快喙尾琵琶甲藥用昆蟲開發和利用的進程。