膀胱癌腫瘤標志物檢測方法的研究進展△

田玉婷，任曉委，馮小燕，賈璐璐，鄒立娜，潘洪志，馬宏坤#，榮勝忠#

1牡丹江醫學院公共衛生學院，黑龍江 牡丹江 157011

2牡丹江醫學院附屬紅旗醫院體檢科，黑龍江 牡丹江 157011

3上海健康醫學院協同科研中心，上海 201318

膀胱癌是泌尿系常見惡性腫瘤之一，全球范圍內，每年新發病例數高達43萬例，占所有惡性腫瘤的第11位[1]，具有復發率高、預后差等特點[2]。膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的金標準[3]，但成本較高、具有侵入性[4]，且在檢測原位癌時敏感性較低，具有一定的漏診率[5]。

腫瘤標志物是由腫瘤細胞（或細胞膜表面）產生，或由機體對腫瘤產生免疫反應而生成、分泌或脫落至人體體液或組織中的物質[6]，如核酸、蛋白質、酶及糖類。腫瘤標志物在輔助腫瘤治療、監測復發等方面發揮著至關重要的作用[7]。近年來，多種方法已經應用于膀胱癌腫瘤標志物的檢測，如傳感器[8]、微流控[9]、熒光原位雜交[10]、酶聯免疫吸附試驗[11]、流式細胞術[12]及逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）等[13]，已引起學者的廣泛關注。本文對近年來膀胱癌腫瘤標志物的檢測方法及研究進展進行綜述。

1 傳感器

1.1 DNA電化學傳感器

典型的生物傳感器由生物受體和換能器組成。生物受體與目標分析物相互作用，換能器將這種相互作用轉化為電信號[14]。

DNA電化學傳感器是通過目標DNA與捕獲的寡核苷酸和識別探針相互作用，識別探針與適當的標志物相結合進而實現物質檢測的一種方法[15]。

成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）屬于酪氨酸激酶家族，位于染色體4p163上[16]，是評估膀胱癌患者預后的腫瘤標志物之一，也是尿路上皮性膀胱癌的有效治療靶點[17]。

Chen等[18]將血紅素包裹在金屬有機框架材料（MOFs）和鉑納米粒子（PtNPs）中，制備了血紅素-MOFs/PtNPs復合材料，又利用血紅素-MOFs/PtNPs進行信號放大，因為這種納米材料具有顯著的H2O2催化能力和優良的導電性。為進一步放大電化學信號，選擇還原氧化石墨烯-四乙基戊胺（rGOTEPA）、納米金、鏈霉親和素對電極進行修飾。在最佳條件下，該生物傳感器對FGFR3在0.1 fM～1.0 nM范圍內具有良好的線性關系，檢出限為0.033 fM。

1.2 電化學免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗原和抗體特異性識別和結合的原理設計的一種檢測設備。抗原和抗體分子以某種形式固定在電極表面，并與相應的抗體或待檢測抗原形成穩定的復合物。這些復合物可以引起電化學信號的變化，如電極電位、電流和電容[19]。電化學免疫傳感器的靈敏度受到傳感表面比表面積和電導率的影響[20]。由于具有靈敏度高、檢測快速、小型化、成本低等優點，近年來得到了廣泛的關注和迅速發展。

1.2.1 免標記電化學免疫傳感器核基質蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）可參與DNA重組和復制、RNA轉錄和有絲分裂過程[21-22]，是美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準使用的膀胱癌腫瘤標志物，可以輔助膀胱癌的診斷[23]。Li等[24]以鈷基金屬有機框架材料（Co-MOFs）為載體，在其表面包裹銅金納米線（CuAu NWs），合成了一種菊花狀納米復合材料（Co-MOFs/CuAu NWs），用于修飾玻碳電極。Co-MOFs/CuAu NWs作為信號材料具有優異的催化性能，基于此構建了檢測NMP22的免標記電化學免疫傳感器，線性范圍為0.1 pg/ml～1.0 ng/ml，檢出限為33 fg/ml。榮勝忠等[25]和Rong等[26]采用rGOTEPA固定金摻雜的金屬有機框架材料ZIF8復合膜修飾絲網印刷電極，再將NMP22抗體固定在修飾電極表面，用牛血清白蛋白封閉，建立了免標記電化學免疫傳感器檢測NMP22。在最佳檢測條件下，傳感器的線性范圍為0.01～1000.00 ng/ml，檢出限為3.33 pg/ml。

1.2.2 三明治電化學免疫傳感器Wu等[27]以氨基功能化的硅鋁磷酸酯分子篩（NH2-SAPO-34）為載體的Pd/Co納米顆粒（NH2-SAPO-34-Pd/CoNPs）為標記物，研制了一種新型的三明治電化學免疫傳感器用于檢測NMP22，線性范圍為0.001～20.000 ng/ml，檢出限為0.33 pg/ml。

1.3 電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）傳感器

ECL傳感器是電化學氧化還原反應產生的一種發光傳感器，結合了化學發光和電化學的優點[28]，通過化學修飾電極來改變其表面的微觀結構，從而增強傳感器的靈敏度和選擇性。通過電極表面特殊的修飾材料來增強ECL體系，有望擴大ECL的研究范圍[29]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～24個堿基對單鏈分子組成的小型非編碼RNA[30]，通過降低靶mRNA的穩定性或抑制翻譯效率調控基因表達[31]，在調控腫瘤發生發展、轉移和血管生成中發揮重要作用[32]。

Xu等[33]將Hemin/g四聯體DNAzyme組裝在氮化碳納米片和納米金修飾的電極上，在過量的H2O2存在下，較低的目標濃度下Hemin/g四聯體DNAzyme對H2O2的催化還原使ECL強度恢復，較高的目標濃度下電極表面生物催化沉淀（biocatalysis precipitation，BCP）誘導的電荷轉移阻力導致ECL降低，基于H2O2和BCP催化還原引起的ECL的強度變化實現了膀胱癌腫瘤標志物miRNA-141的檢測，線性范圍為10-17～10-9M，檢出限為7.9 M。Zhang等[34]以Zn-Ag-In-S（ZAIS）納米晶為模型研究了多晶納米晶（NCs）的ECL傳感器，可溶性ZAIS NCs可以產生以三丙胺為共反應物的高效還原氧化ECL傳感器，以ZAIS/ZnS NCs為標記，制備了一種超靈敏的ECL傳感器，實現了膀胱癌腫瘤標志物miRNA-141的檢測，線性范圍為0.1～20.0 pmol/L，檢測下限為50 amol/L。

2 微流控

微流控是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間對流體進行操控的技術[35]，芯片是實現流體操控的載體[36]。微流控具有設備體積小、使用樣品和試劑量少、運行成本低、檢測時間短等諸多優點[37-38]。

Lin和Peng[39]建立了一種基于磁珠的免疫分析方法，在半導體傳感器中嵌入微流控芯片，使用二抗標記帶負電荷的DNA片段進行信號擴增，外加的磁力將分析物緊密地附著在傳感器表面，從而有效解決了分析物到傳感器表面距離較長的問題，進而實現載脂蛋白A1的檢測，檢出限為12.5 ng/ml。膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）由膀胱癌細胞產生，當腫瘤侵入間質時釋放至尿液中，美國FDA已經批準其可以作為膀胱癌腫瘤標志物。BTA測試是使用單克隆抗體檢測尿液中的補體因子相關蛋白，可以在數分鐘內完成，無需對尿液樣本進行任何預處理[40]。Jiang等[9]制備了紙基微流控分析裝置，檢測了尿液樣本中的NMP22和BTA，結果顯示該方法的檢出率可達90.91%。

3 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）

FISH是依據堿基互補配對原理，應用熒光素直接或間接標記核酸探針，在組織切片、細胞涂片、染色體鋪片上檢測間期細胞核染色質數量及結構的變化，進而定性和定量分析目標物的檢測技術[41]。FISH作為一種分子水平檢測膀胱癌腫瘤標志物的方法，具有無創、靈敏度高、易于采集等特點，臨床應用前景廣闊。

Riesz等[42]使用FISH技術檢測尿液中尿路上皮細胞的基因突變情況，將熒光直接標記的DNA探針結合到3、7、17號染色體和9p21位點的著絲點周圍，對43例膀胱癌患者和12例無或良性突變膀胱癌患者的尿液樣本進行了研究，所得FISH結果與經尿道手術切除標本的組織學結果進行比較，特異度和靈敏度分別為100%和87%。Karnwal等[43]以48例膀胱癌患者為研究對象，分別比較了FISH、細胞學檢查、膀胱鏡檢查3種方法預測膀胱癌復發的靈敏度和特異度，3種方法的靈敏度分別為63%、42%和98%，細胞學檢查預測膀胱癌復發的特異度為89%，明顯高于FISH檢查的65%及膀胱鏡檢查的41%。

4 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）

ELISA是將已知的抗原（抗體）吸附于固相載體表面，加入抗體（抗原）與酶結合成的偶聯物，通過加入酶底物的顯色劑來確定抗原抗體結合量的方法[44]。survivin是細胞有絲分裂的重要調節因子，也是細胞凋亡的抑制因子，可以促進腫瘤細胞的增殖，誘導新生血管生成，從而增強腫瘤細胞的侵襲能力[45]，是一種新型膀胱癌腫瘤標志物[46]。Li等[47]建立了一種用于檢測survivin的ELISA，檢出限為0.0625 ng/ml，以0.09 ng/m（l檢測波長450 nm）作為最佳截斷值，診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為70.6%和89.2%。Arya和Estrela[48]建立了一種新型電化學ELISA檢測平臺用于NMP22和補體因子H相關蛋白1（complement factor H related 1，CFHR1）的檢測，NMP22和CFHR1抗體用于免疫分析，梳狀金電極用于傳感，線性范圍為1～100 ng/ml，NMP22和CFHR1的檢出限分別為260 ng/ml和310 ng/ml。

5 流式細胞術

流式細胞術是將熒光標記抗體標記的細胞通過光探測區時可以被高度聚焦的激光束檢測，通過分析細胞的熒光和（或）散射特性明確細胞性質和狀態[49]。流式細胞術是評估多種腫瘤標志物表達、區分細胞群及細胞亞群的有效方法[50]，廣泛應用于免疫學、病毒學、分子生物學、腫瘤生物學及傳染病學等多個學科。

CK20在正常膀胱黏膜移行細胞中不表達，在膀胱移行細胞癌中高表達，因此可以作為膀胱癌的腫瘤標志物。Barlandas-Rendón等[51]以115例膀胱癌患者為研究對象，采用流式細胞術分析尿液中CK20和CD45的表達，同時進行細胞學分析，陽性病例中組織學確診21例，流式細胞術確診18例，細胞學確診16例，兩種方法的檢測靈敏度分別為85.7%和76.1%。邱蓮女等[52]利用流式細胞術對良性血尿、膀胱良性腫瘤及膀胱癌患者尿脫落細胞進行DNA倍體和S期組分（S phase fraction，SPF）分析發現，膀胱癌、膀胱良性腫瘤患者的SPF明顯高于良性血尿患者，提示尿脫落細胞DNA流式細胞術可以成為診斷及評估膀胱癌預后的輔助方法。

6 RT-PCR

RT-PCR通過mRNA生成互補DNA（complementary DNA，cDNA）轉錄本定性檢測基因表達，并用熒光探針定量檢測cDNA的擴增，RT-PCR的過程包括3個步驟：RNA逆轉錄為cDNA、PCR擴增cDNA、擴增產物檢測[53]。Ribal等[54]采用RT-PCR法分析了57例浸潤性膀胱癌根治術患者和9例非浸潤性膀胱癌患者外周血、骨髓、淋巴結、腫瘤組織及正常膀胱組織中的膀胱癌腫瘤標志物CK20的表達情況，57例患者中有24例淋巴結陽性，56例均有CK20的表達，組織學和RT-PCR的陽性結果在95.8%的研究患者中一致，因此RT-PCR法檢測CK20是一種檢測浸潤性膀胱癌患者循環腫瘤細胞和淋巴結殘留病變的高靈敏度和特異度方法。

Kenney等[55]采用RT-PCR法檢測了118例膀胱癌患者、50例有膀胱癌病史的患者、68例未確診膀胱癌的患者和55例血尿患者尿液中膀胱癌腫瘤標志物survivin的水平，發現RT-PCR法檢測膀胱癌患者尿中survivin表達的靈敏度和特異度分別為79%和93%，檢測初診膀胱癌患者尿中survivin表達的靈敏度和特異度分別為83%和95%，檢測復發性膀胱癌患者尿中survivin表達的靈敏度和特異度分別為82%和90%，對血尿膀胱癌的檢測靈敏度和特異度分別為80%和90%，因此RT-PCR是一種高靈敏度與高特異度、無創的survivin檢測方法。

7 小結與展望

上述檢測方法中，傳感器具有方便、快速、靈敏、選擇性高的優點，已發展成為定性、定量檢測的重要手段，正向檢測自動化、小型化、集成化的方向發展；微流控技術具有集成小型化、自動化、高通量、檢測試劑消耗小、污染少等優點，但存在成本高、核心技術不規范等不足；FISH技術是一種具有較高靈敏度、特異度、無創的臨床診斷方法，但較高的費用可能限制其廣泛應用；ELISA方法具有很高的靈敏度、特異度，并且操作簡單、易于標準化，但結果不穩定；流式細胞術精度高，但所用儀器價格昂貴，限制了其普及應用；RT-PCR具有靈敏、快速、特異度高等優點，但具有可重復性低、易污染等缺點。

腫瘤標志物作為腫瘤輔助診斷、治療效果評估和預后判斷的重要指標，目前得到了廣泛應用。雖然檢測腫瘤標志物的方法很多，但各自存在一定的缺點，目前尚無一種方法診斷膀胱癌的靈敏度和特異度達到100%，因此，通過科學開展多種腫瘤標志物聯合檢測和聯合應用多種檢測方法可以在一定程度上提高膀胱癌的檢出率，提高防治的效果。

貢獻聲明田玉婷負責文章撰寫及修改，任曉委、馮小燕、賈璐璐、鄒立娜負責資料收集、整理及翻譯，潘洪志、馬宏坤、榮勝忠負責反復審校及潤色修改。