LncRNA在腎癌診治及預后方面的研究進展

程 波，鄒 菊，向碧蘭，王 倩，劉 威，葉 濤

1.西南醫科大學附屬醫院泌尿外科（瀘州 646000）；2.西南醫科大學臨床醫學院（瀘州 646000）

腎癌又稱腎細胞癌（Renal cell carcinoma，RCC），在我國RCC 發病率呈現逐年上升趨勢，男女比例為2.6 :1[1]。腎透明細胞癌（Renal clear cell carcinoma，ccRCC）是RCC中最常見的一種，約占RCC 的75%～80%[2]。目前腎臟CT 和B 超是國內診斷腎癌最常用的輔助檢查方法。RCC早期缺乏明顯的臨床癥狀，而且沒有典型的腫瘤標志物供其早期診斷，部分RCC 患者初次就診時即為RCC晚期，無法進行手術，預后較差[3]。隨著分子生物學的進展，越來越多的LncRNA 被證實參與了RCC 細胞內多種重要的調控過程。LncRNA 是一類特殊類型的RNA，是指長度大于200bp 的非編碼RNA，主要存在于核內，研究表明，LncRNA參與了基因調控的基本過程，包括染色質的修飾和直接的轉錄調控，同時也調控轉錄后事件，根據LncRNA功能和涉及的分子機制可將其分為信號分子、誘餌分子、引導分子和支架分子等四類[4]。LncRNA 雖然不具有編碼蛋白質的功能，但能在不同的腫瘤組織中過度表達或表達不足，在特定類型的癌癥中，許多LncRNA已被證明是有效的潛在生物標志物[5]。本文綜述了LncRNA在腎癌分子領域發揮的作用，并探討LncRNA 作為腫瘤標志物在腎癌的診斷、治療以及預后方面的研究進展。

1 LncRNA用于RCC的診斷

目前RCC 的診斷金標準主要依賴于腎組織活檢，但活檢本身具有創傷性，難以重復檢測且不適合用于大規模人群篩查[6]，因此需要更加簡便的診斷手段。由于LncRNA可以在幾種體液中檢測到并可以抵抗核糖核酸酶介導的降解，因此它們有希望成為用于篩查腎癌的生物標志物。無創血清學和尿液指標用于早期篩查診斷具有重要的臨床價值。研究表明，5-Ln?cRNA-let、PVT1、PIDAR、PTENP 1 和LINC 00963 在ccRCC 患者血清中表達下調，其對ccRCC 的診斷有很強的指示意義，可以鑒別ccRCC患者和健康對照組，這種多指標聯合檢測一定程度上彌補了單指標的不足，提高了LncRNA診斷RCC的敏感性和特異性[7]。HE等[8]也表明，GIHCG 在RCC 組織中高表達，且與血清GI?HCG表達水平呈正相關，還能區分RCC患者和健康個體，敏感性和特異性分別為87%和84.8%（AUC=0.920）。此外，通過檢測外周循環中LINC 00887 鑒別RCC 患者與健康受試者的AUC 為0.8001，敏感性為71.05%，特異性為89.87%，提示了LINC 00887 可作為早期RCC檢測的一個潛在生物標志物[9]。而在一些較新的研究方面，如在尿液研究方面發現兩種LncRNA（Ln?cRNA NR 040448和LncRNA NR 033390）在成熟的腎癌細胞系、腎癌尿液外泌體樣本中均高表達，有希望成為RCC早期診斷的潛在標記物[10]。這些LncRNA可能會成為未來的發展研究方向。

2 LncRNA用于RCC的治療

目前傳統的治療方式尚不理想。靶向藥物索拉菲尼、蘇尼替尼取得了飛速發展，從根本上改變了晚期腎細胞癌（mRCC）的治療前景，成為治療RCC的新策略，但其療效仍有缺陷[11]。而大量研究顯示了特異性Ln?cRNA在RCC的侵襲、增殖、轉移中發揮了重要的生物調控作用，那么針對LncRNA 靶點聯合分子靶向藥物可能為治療RCC提供新的思路。

2.1 通過干預LncRNA改善靶向藥物療效

當下，以舒尼替尼和索拉菲尼為代表的受體酪氨酸激酶抑制劑已經被廣泛應用于臨床。然而，約有15%的進展期腎癌患者對靶向藥物先天耐藥，其余患者在接受舒尼替尼治療6～15 個月后也往往出現耐藥和疾病的情況[12]，而大約22%的患者在早期即對索拉非尼敏感性下降[13]。目前已發現幾種與耐藥相關的Ln?cRNA，隨著耐藥機制被逐漸揭示，通過阻斷耐藥信號通路或提高/降低LncRNA表達量等方法可提高RCC對藥物的敏感性，將為耐藥患者的治療提供新方法。因此，針對特異性LncRNA 來改善靶向藥物治療效果成為一個新的研究方向。

QU 等[14]研究顯示LncARSR 作為競爭性內源RNA（ceRNA）競爭結合miRNA家族，解除對AXL和c-MET的抑制作用，導致舒尼替尼耐藥的形成。LncARSR還可通過外泌體傳播導致舒尼替尼耐藥，因此靶向Ln?cARSR 和AXL/c-MET 能消除RCC 對舒尼替尼的耐藥性。徐志鵬等[15]的研究顯示，RCC索拉非尼耐藥細胞中高表達LncRNA-SRLR，LncRNA-SRLR 通過與NF-κB結合促進IL-6 轉錄，進而激活STAT3使腎癌細胞系對索拉非尼耐藥。另一方面，LIANG等人[16]研究發現靶向LncRNA 的另一種方法是使用反義寡核苷酸（ASO）干擾RNA 表達。ASO 技術是指根據堿基互補配對原理，將用人工合成的靶標mRNA 互補配對的DNA 和RNA導入生物體內，從而用于基因的靶向治療[17]。這些寡核苷酸能夠識別LncRNA的序列，阻斷LncRNA與靶標的相互作用，還可通過核糖核酸酶H或RNA誘導的沉默復合物使LncRNA 降解[16]。然而，關于這項技術在腫瘤的應用研究中仍然有許多問題待解決，如反義寡核苷酸易于降解，進入細胞前失去特異的反義活性會降低精確的體內遞送，此外，動物體內實驗證實，反義寡核苷酸代謝產物會造成一系列的不良反應[18]。

2.2 LncRNA影響腫瘤侵襲和轉移能力

腫瘤的侵襲和轉移涉及多種信號轉導途徑，它使癌細胞能夠增殖、改造周圍環境，并侵入新的組織，這為腎癌的治療帶來了極大的挑戰。因此明確腎癌侵襲和轉移的分子機制，對于尋找腎癌腫瘤標志物、實現早期診斷和分子靶向治療具有重要意義。大量的研究表明LncRNA 能作為腫瘤的促癌或抑癌基因，在RCC 的侵襲和轉移中起重要作用。

一些LncRNA 具有促進腫瘤侵襲和轉移的能力。如LncRNA 可通過影響甲基化途徑調控腎癌發生發展，LncRNA MRCCAT1結合EZH2后能促進H3K27甲基化來抑制NPR3 啟動子的轉錄[19]。有研究著重強調了LncRNA 在轉錄調控中對于miRNA 的重要性，胞漿中的LncRNA 可作為一種“海綿”與堿基直接配對，吸附內源性的miRNA，參與ceRNA 調節網絡。如靶基因XI型膠原α1 鏈（COL11A1）的釋放就是LncRNA SNHG12通過調節ceRNA完成的，而LncRNA RP11-436H11.5則通過影響miR-335-5p上調BCL-W的表達來發揮ceR?NA的作用[20-21]。LncRNA還可以抑制microRNA-206表達進而調控VEGF，VEGF是由細胞產生的一種信號蛋白，是一種強有力的促血管生成因子，能刺激血管的形成和淋巴管的生成，在腎癌的發展中起重要的作用，VEGF 受microRNA 的 調 控，microRNA 又 與 多 種Ln?cRNA 呈負相關[22-23]。LncRNA 通過調控表皮生長因子樣結構域7（EGFL7）蛋白影響RCC，EGFL7在生理狀態下發揮調控內皮和血管生成的作用，而在病理狀態下可通過自分泌/旁分泌方式參與腫瘤轉移過程。Ln?cRNA-URRCC則能通過調節EGFL7 啟動子組蛋白H3乙酰化，增加EGFL7 的表達[24-25]。此外，之前有研究表明，近80%的RCC 處于缺氧狀態，缺氧也會影響Ln?cRNA的水平或者功能，VHL基因突變或缺失導致的缺氧誘導因子（HIF）途徑激活是RCC 的驅動因素，而過度表達的LncRNA-ENST00000574654.1抑制這種途徑可影響RCC的侵襲[26]。

另外，一些LncRNA 能抑制腫瘤侵襲和轉移。EMT具有促進腫瘤細胞侵襲的重要作用，DLEU1可抑制EMT 過程，在實驗中敲除DLEU1基因后，上皮細胞標記物E-cadherin 表達增加，N-cadherin 和vimentin 表達減少，p-Akt、cyclinD 1 和p70S6K 的表達顯著降低，KETR 3和786-O細胞的遷移和侵襲能力下降，下調磷酸化的Akt、cyclinD 1和P70S6激酶的表達而抑制蛋白激酶B（Akt）通路，對RCC 細胞BCI-21BAX 和Caspase級聯的調控誘導細胞的凋亡增加。LncRNA BX357664作為抑癌基因通過阻斷EMT 過程而抑制RCC 細胞的侵襲和轉移[27-28]。MEG3作為腫瘤的抑癌基因，MEG3定位于人類染色體14q32.3 上，與DLK1基因構成DLK1-MEG3印記基因，MEG3對P53有激活作用，P53上調miR-124 的表達，miR-124 直接以表觀調控因子TET1為靶點，誘導MEG3的表達，在ACHN和786-O細胞中，miR-124 和meg 3 過表達后，磷脂酰肌醇3-激酶（Pi3k）、Pakt 和perk 蛋白水平下降，PTEN 表達上調，RCC 中過表達miR-124 和MEG3可抑制PTPN11 蛋白的表達而抑制腎癌細胞的增值和EMT過程，進而抑制RCC 的侵襲和轉移[29-30]。LncRNA-SARCC是ccRCC中重要的多效性LncRNA，在VHL 沉默的ccRCC 中，Ln?cRNA-SARCC通過結合和去穩定雄激素受體（AR）發揮腫瘤抑制作用，相反，LncRNA-SARCC在VHL 野生型ccRCC組織中具有致癌性，但其機制不清[31]。還有一些LncRNA 可以作為內源性競爭性RNA（ceRNA）與mi?croRNAs 結合，從而消除了microRNA 對靶基因轉錄的抑制作用[32]。

2.3 對腎癌細胞增殖能力的影響

LncRNA 表達譜的研究發現其從多個方面參與了RCC 的增殖，因此研究LncRNA 在RCC 中的具體作用機制有助于為臨床治療提供新的靶點。

2.3.1 LncRNA 對增殖的促進作用 在敲除基因Ln?cRNA TP73-AS1的細胞中，KAS-1轉移抑制因子（KISS 1）明顯上調，TP 73-AS1通過與ZAST 同源物2（EZH2）的增強子相互作用以及與KISS 1基因啟動子區的特異性結合而抑制KISS 1的表達，LncRNA TP73-AS1通過介導H3K27me3 將EZH2 引入KISS 1啟動子區域并抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活可保護不同類型的細胞免于因生存因子的退出而引起的凋亡[33]。AKT 通過磷酸化和滅活多個靶標來抑制凋亡從而促進了細胞的增殖。通過新基因編輯系統CRISPR/Cpf1 敲除腎癌細胞中的LncRNA458314，76P細胞中pAKT 表達水平下降，推測LncRNA458314可能激活了pAKT 的表達，從而促進了腎癌的發生發展[34]。LncRNA在腎癌轉錄方面也發揮著重要的作用，LncRNA不僅可以與mRNA結合增加mRNA 的穩定性，也能調節mRNA 翻譯的速率來改變轉錄產物的表達量。LncRNA EGFR-AS1通過與Hur 結合來維持EGFR mRNA 的穩定性使EGFR 蛋白表達增加，從而促進腎癌細胞的增殖[35]。研究顯示，RP11-567G11.1在晚期腎癌組織中高表達，敲除Ln?cRNA RP11-567G11.1后可顯著降低RCC 細胞中Jag?ged 1、HES 5和HEY 1 mRNA和蛋白水平，同時也可降低細胞存活率，從而誘導DDP誘導的RCC細胞凋亡[36]。LncRNA 作為miRNA 的海綿，研究發現ERβ調控的HOTAIR能通過拮抗miR-138、miR-200 C、miR-204或miR-217在內的多種microRNA來影響各種癌基因，包括ADAM 9、CCND 2、EZH2、VEGFA、VIM、ZEB1和ZEB2[37]。

2.3.2 LncRNA對增殖的抑制作用 在ACHN細胞中，KCNQ1DN基因敲除可顯著上調細胞周期蛋白D1的表達，但在mRNA 和蛋白水平下調p27的表達，增強了細胞G1期的進展，甲基化分析表明，KCNQ1DN啟動子的近端區域在RCC 組織中發生高度甲基化，C-Myc是一種常規轉錄因子，通過綁定到順式-C-myc基因的調控元件E-box（CACGTG）調控細胞周期、細胞增殖、凋亡和細胞代謝等生物學過程，KCNQ1DN通過抑制c-Myc基因啟動子的轉錄活性而下調c-Myc，進一步上調細胞周期素D1，抑制p27在RCC 細胞中的mRNA 和蛋白水平，從而抑制RCC細胞的生長和細胞周期進程[38-40]。Ln?cRNA NBAT1對miR-346 的表達具有負調控作用，NBAT1 作為miR-346 的分子海綿，抑制miR-346 靶向基因GSK-3β，進而抑制Wnt/β-catenin 的激活，從而抑制RCC細胞的生長和增殖[41]。

3 LncRNA用于RCC的預后

目前臨床上針對RCC 并無特異性的預后標志物。由于LncRNA在RCC的發生及發展中發揮重要的調控功能，且檢測LncRNA 更為方便無創，因此LncRNA 有望成為RCC預后的重要參考指標。

以往的研究中，SDPR被報道是惡性腎腫瘤早期檢測和鑒別的可能生物標志物[42]。在WEN[43]的研究中發現LncRNA SDPR-AS在RCC 組織中低表達，且低表達提示總生存期較差，并與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關。LncRNA NONHSAT113026可能是RCC的抑癌基因，NOAT113026與NF-κB的表達呈負相關，NF-κB主要發揮促進細胞增殖、細胞周期進程、抗凋亡、血管生成和炎癥激活的作用，進一步研究提示Ln?cRNA NONHSAT113026的表達水平越低，RCC 患者無病生存期和總生存期就越短[44-45]。此外，LINC00475高表達的腎癌患者腫瘤stage 分期（P=0.010）、M 分期（P=0.022）更高，腫瘤遠處轉移更多，其可能作為一種潛在的RCC 預后不良指標。具體機制可能通過激活WNT信號通路促進腎癌的進展[46]。WANG等[32]的研究發現LncRNA 00312主要通過抑制microRNA使ASS1表達正常化而發揮抗腫瘤作用，其低表達的患者在腫瘤大小、病理分級和TNM 分期等方面情況更差。YU等[47]通過檢測腎癌與癌旁組織表達差異發現，LncRNA PVT1在腫瘤中高表達，Kaplan-Meier 分析顯示，高PVT1 表達總體生存率更低（P=0.007）。LIU 等[48]的研究中，在RCC 組織中低表達的TCL6 和三個高表達的（PVT1，MIR155HG和HAR1B）LncRNA組成一個多LncRNA預測系統，這個基于多個LncRNA 綜合預后預測系統與RCC 患者總生存期顯著相關，高風險LncRNA 評分的患者的總生存期低于低風險LncRNA 評分的患者，該系統具有作為ccRCC 預后的獨立標志物的潛力。楊清等[49]用meta 分析方法納入27 篇針對2 967 名癌癥患者的研究，顯示非編碼RNA對于癌癥預后可能是預測因子，且LncRNA與miRNA之間存在相關性，可能共同發揮作用影響癌癥預后。

4 小結與展望

LncRNA 對RCC 診斷、治療以及預后等方面均有著非常重要的作用。得益于高敏感度分子生物學檢測技術的推廣，將發現LncRNA更多的作用與功能，但由于LncRNA的表達豐度較低等因素，目前LncRNA檢測尚不能完全用于RCC 患者的臨床早期診斷及預后判斷，特別是針對特異性LncRNA靶點的研究還較少，相關的治療研究也主要停留在細胞及動物模型層面，但LncRNA在這些方面有著良好的應用前景，未來極可能有針對LncRNA 靶點的藥物上市，以期提高RCC 患者生存率。

（利益沖突：無）