異構酶Pin1生理特性與其在腫瘤中的作用研究進展

黃恩雨，馬音曉 綜述 何志巍 審校

廣東醫科大學中美腫瘤研究所（東莞 523808）

脯氨酰順反異構酶1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）是一種分子量為16KD的小分子蛋白，包含N末端的WW結構域和C末端PPIase結構域[1]。WW結構域是異構酶與靶蛋白結合部位，能夠特異性結合在磷酸化蛋白的絲氨酸/蘇氨酸-脯氨酸（phosphorylated Serine/Threonine-Proline，pS/T-P）基序上，PPIase結構域在此基礎上對靶蛋白發揮異構作用。研究發現Pin1作為關鍵的信號調節蛋白，在侵襲性腫瘤中普遍高表達，并與腫瘤的發展和預后密切相關[2]。Pin1在腫瘤中的作用機制已成為目前腫瘤防治的研究熱點。

1 Pin1的生理特性

Pin1 的兩個不同的結構域分別行使不同的功能，其中N末端WW結構域識別并結合靶蛋白pS/T-P結構域，而C 末端PPIase 結構域執行順反異構化功能[1]。Pin1 定向結合靶蛋白的脯氨酸前磷酸化位點，再使之異構化，從而導致靶蛋白的構型發生改變，影響其穩定性、亞細胞定位、蛋白質-蛋白質相互作用及其它翻譯后修飾等。因此，Pin1 能夠調節磷酸化蛋白質的功能。Pin1 磷酸化被認為是Pin1 異構酶活性的一個標志，S/T-P在蛋白質底物上的磷酸化是其與Pin1結合活性及隨后異構化的前提[3]。由于S/T-P上蛋白質的磷酸化是控制細胞增殖和轉化的關鍵調控機制，能廣泛參與器官發育和代謝的調節，故Pin1在細胞周期進程、合成蛋白折疊和DNA損傷反應中起著重要作用[3]。

1.1 Pin1在信號轉導中的全局作用

Pin1在信號傳導中主要有三個作用。其一，Pin1能夠特異性結合在pS/T-P基序，使得Pin1被視為與脯氨酸導向激酶相關聯的“讀寫器”。一些報告證明，Pin1在許多蛋白質上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化之后連接脯氨酸，再通過異構活性而使被結合的磷酸化蛋白發生構象變化，從而達到轉錄后水平的調控模式以及影響磷酸化蛋白的翻譯后修飾引起進一步的調節，例如通過促進靶蛋白與其他激酶、磷酸酶、乙酰轉移酶等的結合[4]。

其二，Pin1能優化信號轉導，對組織發育有重要影響。Pin1 通過調節一條通路的單個成員以及它們的同源激活劑和抑制劑，最終確定其激活狀態的水平，來實現對信號轉導通路的微調和放大作用。例如：人類乳腺上皮細胞中生長因子激活的RAS/MAPK 途徑，因為Pin1 被證明在所有信號轉導水平上都起到放大作用，包括穩定受體、增強轉導激酶的活化、增加穩定性轉錄因子和效應因子的作用，進而促進了這種信號轉導，促進細胞增殖[5]。此外，Pin1還參與其他信號途徑的調節，并控制RAS/MAPK途徑和蛋白磷酸酶以外的幾種激酶的水平和活性，故被稱為腫瘤發生的“催化因子”[4]。

其三，Pin1能調控基因的表達。研究表明Pin1能夠通過控制轉錄調節蛋白和參與RNA剪接、mRNA降解、DNA修復、rRNA沉默和核糖體的組裝等過程來影響基因的轉錄[6]。此外，Pin1 還能調節表觀遺傳調控因子和轉錄因子，直接影響轉錄機制和轉錄后事件，并在基因特異性和整體調控基因表達方面發揮作用[7]。

1.2 Pin1在細胞周期中的調控作用

細胞增殖的一個普遍機制是以脯氨酸為導向的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化，其強調Pin1的多水平干預。在細胞周期的整個過程中，Pin1 對多種磷酸化蛋白的調節以及在各種信號中發揮的作用是影響細胞周期進程和細胞分裂的關鍵[8]。

在哺乳動物細胞中的研究揭示，Pin1 動態控制細胞周期調節蛋白的功能在細胞周期的所有階段都是必需的[8-9]。在正常細胞中，細胞周期蛋白的水平會有適度的波動，這對于細胞從一個階段進展到另一個階段是至關重要的，特別是細胞周期蛋白D（cyclin D）和細胞周期蛋白E（cyclin E），在細胞周期進程中，它們的水平迅速升高而后降解，在結合并激活特異性細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）后，在轉錄和轉錄后水平上強烈依賴Pin1的活性。研究表明Pin1能夠引起磷酸化的視網膜母細胞瘤抑制蛋白（pRB）異構化，從而調節pRB 的進一步磷酸化和細胞周期進程中pRB 的失活，同時，Pin1 與pRB 形成的Pin1-pRB 復合物釋放出E2F（E2F 轉錄因子家族是參與細胞周期及細胞凋亡重要的調節因子），以此來控制G1-S期（細胞周期G1期至S期）轉變[10]。在S期，Pin1能夠調控DNA的合成和中心體復制[11]以及RNA聚合酶II在轉錄基因啟動子上的動態關聯[12]。此外，Pin1還控制G2-M 期轉換，在G2 期Pin1 與早期有絲分裂抑制因子1（Emi1）結合，并阻止Emi1 與SCF（Skp1-Cul1-Fbox）在異構化依賴的途徑上的關聯，從而保護了Emi1在G2期免被降解，細胞周期蛋白A（cyclin A）和細胞周期蛋白B（cyclin B）通過Pin1依賴的Emi1在G2期間的穩定積累誘導細胞進入S期和M期[13]。這些研究證實Pin1在細胞周期中發揮著重要的調控作用，是細胞周期進程的微調器。

除了能夠調控細胞周期外，Pin1 還能通過調控抑癌基因p53及p73的水平，同時促進基因毒性應激后的Che-1蛋白（一種人RNA聚合酶II結合蛋白）降解[14]，從而參與并促進細胞DNA損傷后的凋亡反應。

2 Pin1在腫瘤中的作用

腫瘤發生是一個多步驟和多因素的過程，在遺傳水平和表觀遺傳水平上的改變，導致細胞出現失控的細胞增殖和轉化，其中細胞增殖和轉化的一個主要調控機制是蛋白質在脯氨酸前的絲氨酸或蘇氨酸殘基上被各種蛋白激酶的磷酸化。研究發現Pin1 可以激活或穩定多種腫瘤蛋白，以及通過抑制一些抑癌基因的表達或使抑癌基因失活來促進腫瘤的發生[15]。通常情況下，Pin1在大多數正常組織中的表達水平很低，其表達與細胞增殖有關，高水平的Pin1 只存在于少數細胞類型中。然而，Pin1 在許多人類腫瘤中過度表達，例如鼻咽癌、乳腺癌和肝癌等[9]，在癌癥患者中，Pin1的表達水平與臨床預后及疾病進展密切相關[16]。這些結果表明，Pin1在大多數人類腫瘤中的高表達能使其成為很好的預后標志物，抑制Pin1 的過度表達可以抑制腫瘤細胞轉化表型和抑制腫瘤細胞生長，其對人類癌癥的發病機制、診斷和治療有重要意義。

2.1 Pin1與肝癌

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，飲酒和乙肝病毒（HBV）或丙肝病毒（HCV）感染是導致HCC 發生的重要因素[17]。HCC 惡性程度高、發展迅速且隱蔽、晚期治愈率低，并具有侵襲和轉移的潛能。絕大多數肝癌患者在確診后一年內死亡，其原因是缺乏有效的靶向藥物，無法同時阻斷多種癌癥驅動途徑。Pin1 在70%左右的肝癌患者中過度表達并促進肝癌的發生，同時HCC預后不良伴隨著Pin1 的高表達[18]，研究表明Pin1 通過與不同底物的相互作用，誘導肝癌細胞增殖，促進細胞轉化和抑制細胞凋亡[19]。由此可見Pin1 在肝癌轉移和預后中起到關鍵作用。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼小RNA，通過抑制蛋白質翻譯或破壞靶基因的穩定來調節轉錄后基因表達的水平[20]。在肝癌中，miRNA表達下調，這可能是由miRNA的合成缺陷引起的，而Pin1 能夠通過改變輸出蛋白5（exportin-5，XPO5）的構象來降低XPO5 從細胞核向細胞質輸出miRNA 前體的能力，從而引起成熟miRNA 水平下降，以此促進肝癌的發展[21]。上述研究提示，靶向抑制Pin1有望成為治療肝癌的新策略。索拉非尼（Sorafenib）是目前唯一一種治療晚期肝癌的靶向藥，但總體療效欠佳，ZHENG等[22]的研究發現下調Pin1可提高索拉非尼抗腫瘤的作用。研究證實應用Pin1抑制劑API-1（一種6-o-芐基鳥嘌呤衍生物）[23]、全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）[24-25]以及在API-1 基礎上改進的API-LP（API-1 載入脂質體）[26]等可有效抑制肝癌細胞的生長。此 外，NG 等[27]的研 究 證 明Pin1 與RhoA 和RhoC的轉錄水平顯著相關，且肝癌的轉移和復發與它們的共同高表達相關。以上結果表明抑制Pin1 或者聯合抑制Pin1/RhoA/RhoC有望成為治療肝癌的新方法。

2.2 Pin1與乳腺癌

乳腺癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤，盡管在乳腺癌上已經有激素治療、手術治療、輔助治療等方式，但乳腺癌的轉移以及耐藥性，使得乳腺癌的治愈仍然具有挑戰性[28]。有研究發現Pin1 能夠增強多種致癌信號通路和抑制腫瘤抑制因子，進而導致乳腺癌的發生[29]。Pin1在腫瘤中很少發生突變，然而由于其過度表達，增強了有絲分裂信號傳導功能，從而促進腫瘤生存和生長[30]。因此，要提高乳腺癌的臨床療效，就需要更好地了解Pin1 在乳腺癌中的作用機制，從而尋找更有效的治療乳腺癌的方法。

KHANAL 等[31]研究發現Pin1 是Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）/轉錄共激活因子PDZ結合基序（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）正向調控因子，在乳腺癌的發生和腫瘤細胞耐藥性中起作用，Pin1 與YAP/TAZ 癌蛋白結合穩定了YAP/TAZ蛋白表達水平，增加了YAP/TAZ的致瘤和耐藥活性，未來的聯合治療可以同時靶向Pin1和YAP/TAZ。而LIU 等[32]的研究表明咪草酯（imazamethabenz）能有效抑制Pin1，進而抑制人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖、遷移和侵襲，這為開發新型Pin1 抑制劑奠定了基礎。同時，SAMANTA等[33]研究發現WA（withaferin A）對乳腺癌細胞生長抑制作用更強，這是由于WA 給藥能夠降低Pin1的表達[33]。此外，HUANG等[34]研究發現抑制Pin1 可以逆轉腫瘤耐藥，Pin1 的高表達會造成乳腺癌對三苯氧胺的耐藥性，而Pin1 抑制劑ATRA 在體內對三苯氧胺耐藥的乳腺癌具有抑制作用，是治療三苯氧胺耐藥的乳腺癌的有效藥物。這一系列的研究都為乳腺癌的分子靶向治療提供了參考方向。

2.3 Pin1與鼻咽癌

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）作為一種上皮性惡性腫瘤，在中國廣東和廣西兩地高發，其發病與EB病毒（epstein-barr virus，EBV）的感染顯著相關[35]。研究表明Pin1 在EBV 感染的鼻咽癌細胞及移植瘤中高表達，這揭示了Pin1與EBV感染的鼻咽癌的發生有著緊密聯系[36]。cyclin D1 是受多種信號通路調節的下游基因，主要作用于細胞周期G1/S 期，對細胞的生長發育有著重要的作用，與腫瘤的惡性化和轉移密切相關，被認定為癌基因[37]。徐萌等[38]研究發現Pin1 可通過激活MAPK/JNK腫瘤信號通路，提高cyclin D1的表達。同時，本課題組前期研究表明，在鼻咽癌組織中，激活轉錄因子1（activating transcription factor 1，ATF1）是Pin1 的新的調節靶分子，高表達的Pin1 主要通過作用于ATF1 的第184 位的磷酸化氨基酸而使活化的ATF1（即磷酸化蘇氨酸184 位點，pATF1T184）蛋白穩定性增加，從而使ATF1 過表達并促進鼻咽癌細胞的克隆形成，進而促進鼻咽癌的發生發展[39]。這些研究說明靶向抑制Pin1 可能有助于鼻咽癌的治療。鼻咽癌患者中除了Pin1的高表達，還存在Pin1基因多態性的情況，本課題組的ZENG 等[40]研究發現廣東地區鼻咽癌患者存在Pin1 2233678（-842G>C）和2233679（-667C>T）的基因多態性，與正常人比較存在顯著差異，證明了這兩個位點的多態性是鼻咽癌發病的風險因子。因此未來除了明確抑制Pin1 對鼻咽癌進展的阻止作用外，還需進一步探究Pin1-842G>C和-667C>T基因多態性與鼻咽癌發病機制的關系。

2.4 Pin1與其他人類腫瘤

除了肝癌、乳腺癌和鼻咽癌外，在黑色素瘤、胃癌、結直腸癌和卵巢癌等瘤種中也存在Pin1 的異常高表達[8，41]。CHEN 等[42]用組織芯片（tissue microarray，TMA）和免疫組織化學方法檢測了Pin1在黑色素瘤不同階段的表達，發現胞漿Pin1 的表達是黑色素瘤的一個預后標志物。ZHANG等[43]的研究發現Pin1的過度表達與彌漫型胃癌患者的晚期腫瘤分期、不良的化療反應和較短的無進展生存期密切相關，此外還發現Pin1 抑制劑能夠增強胃癌的化療敏感性[43]。LI等[44]的研究發現運用雷公藤紅素（Celastrol）可抑制Pin1 的表達而有效抑制Akt、STAT3、P38、JNK、P65和IL-6信號通路，從而誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯，導致卵巢癌細胞的增殖和遷移被抑制，因此他們認為Pin1 可能是卵巢癌治療的新靶點，而celastrol可作為研究Pin1抑制劑的先導化合物。ZHANG 等[45]研究發現Pin1 是Nanog 穩定性的上游調節因子，它保護Nanog 免受SPOP（Speckle-type POZ protein）介導的泛素化和降解，進而促進了前列腺腫瘤的發生發展。以上研究結果表明，Pin1與多種惡性腫瘤的發生發展存在密切聯系，抑制Pin1 的高表達有望成為一種治療惡性腫瘤的新方法。

3 爭議與深入探討

腫瘤的多樣性和復雜性一直是其治療的難點。Pin1 作為一種新近發現的調控因子，是腫瘤發生發展過程中的重要因素。但是Pin1 在腫瘤中的作用仍然存在爭議，一方面Pin1在大多數腫瘤組織中表達上調，促進腫瘤的發生發展，另一方面Pin1 對腫瘤也有抑制作用，比如在腎細胞癌中，基因缺失導致Pin1表達水平下調，而修復Pin1 水平能夠抑制腎細胞癌的發展[46]；在C57BL6背景的小鼠胚胎成纖維細胞中，Pin1的缺失可以升高cyclin E的穩態水平并增加基因組的不穩定性，進而促進癌基因誘導的鼠成纖維細胞的轉化和腫瘤發生[47]；在應激狀態下，Pin1能與抑癌基因P53相互作用，誘導P53產生構象變化，從而增強P53的反式激活活性[48]。因此，抑制Pin1 是抑制腫瘤還是促進腫瘤的發生發展還有待進一步探究。此外，大量研究已經開發出許多Pin1 抑制劑和Pin1 聯合抑制劑，但是這些藥物目前還缺乏相應的臨床應用。

4 小結

目前大量關于Pin1在不同人類腫瘤中的研究有利于更好地了解Pin1調節腫瘤細胞生長的特異性信號途徑，但是Pin1 對不同腫瘤作用機制的探索還有很大空間。通過對Pin1在不同腫瘤中的作用研究發現，Pin1幾乎參與了所有癌癥的生物活性調節，同時促進細胞增殖，說明它是一個潛在的腫瘤共同治療靶點。因此，Pin1誘導腫瘤進展和抑制腫瘤發展的機制值得進一步研究。對Pin1 在腫瘤中的相關研究有助于更好地理解腫瘤的發生發展機制，為Pin1 抑制劑及Pin1 聯合抑制劑的研發和應用指明了方向，同時也為各種人類腫瘤的發展與治療提供了新的視野。

（利益沖突：無）