參萸養心膠囊抗心肌纖維化作用機制

羅 鋼，楊廷富，楊思進，2

1.西南醫科大學附屬中醫醫院心血管內科（瀘州 646000）；2.西南醫科大學附屬中醫醫院國家中醫臨床研究基地建設單位（瀘州 646000）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）現已成為全球導致死亡的首位因素。WHO 數據顯示，心血管疾病死亡人數占比高達31%[1]。心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是大多數心血管疾病共同的病理特征，主要表現為心肌成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質過度沉積[2]。現代研究認為過度心肌纖維化會誘發心衰和惡性心律失常等，從而加重患者病情[3-4]。怎樣遏制心肌纖維化進展是目前亟需解決的醫學難題。然而導致心肌纖維化的原因是多方面的，中醫藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，在治療心肌纖維化上具有優勢[5-6]。

參萸養心膠囊來源于張錫純《醫學衷中參西錄》，由山茱萸、丹參、人參組成。人參大補心之陽氣，輔以山茱萸益氣固脫，丹參清心之淤血，使之補而不滯，利于心脈舒縮啟閉之運動而無所妨礙。綜全方，益氣養陰補心安神，活血通痹，治療心衰氣虛血瘀證。

綜上，過度心肌纖維化是心力衰竭發展到失代償期的最主要病理改變[7]。然而，臨床上參萸養心膠囊對心衰病人治療效果顯著，可提高患者生活質量，減少住院次數。因此推測參萸養心膠囊對心肌纖維化可能具有抑制作用。網絡藥理學具有預測分析中藥治療疾病作用機制的特點，故本研究旨在運用此方法探討參萸養心膠囊抗心肌纖維化可能的作用機制，為臨床應用及后續研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 參萸養心膠囊有效成分和靶點的篩選

通過中藥計算系統生物實驗分析數據庫（The tra?ditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Data?Base and Analysis Platform，TCMSP）檢索出參萸養心膠囊中人參、丹參、山茱萸的有效成分。設定藥物口服利用度≥30%，類藥性指數≥0.18為篩選條件，獲得相應靶點。再通過Uniprot 數據庫（https://www.uniprot.org）對以上靶點名稱標準化。

1.2 疾病靶點的獲取

以“myocardial fibrosis”進行檢索，通過人類基因數據庫Genecards（https://www.genecards.org）獲得心肌纖維化相關靶點，篩選相關性得分（Relevance score）≥10的靶點。

1.3 參萸養心膠囊治療心肌纖維化的網絡構建及分析

以1.1 項獲得的藥物靶點與1.2 項獲得的疾病靶點，通過Venny 圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ven?ny/）取交集靶點，將交集靶點導入String數據庫（https://string-db.org），設置種類為“homo sapiens”，置信度蛋白參數評分（minimum required interaction score）≥0.7，隱藏孤立靶點后，下載TSV 格式蛋白互作關系文件導入Cytoscape3.7.2軟件，構建蛋白互作關系網（Protein-Pro?tein Interaction Networks，PPI），并進一步篩選核心靶點和關鍵靶點。再構建“藥物-成分-核心靶點-疾病”網絡圖，從中獲得參萸養心膠囊治療心肌纖維化的重要成分及關鍵成分。

1.4 核心靶點的基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

通過DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），點擊“Functional Annotation”，在Step1 輸入核心靶點，Step2 選 擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Step3 選 擇“Gene list”，Step3選擇“Submit List”，在List菜單中選擇“Homo saplens”，則得到GO和KEGG分析結果。

1.5 關鍵成分及關鍵靶點的分子對接

從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜查關鍵成分的結構式，運用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件制作結構式后復制到ChemBio3D Ultra 14.0軟件中，構建三維文件以mol2 格式保存。PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白的3D 結構，以PDB格式保存。利用Pymol 軟件去水，進行蛋白與配體的拆分，將蛋白由pdb 格式轉為pdbqt 格式，AutoDockTools 軟件尋找活性口袋，通過Vina軟件得出對接分數值來評價其結合活性，再使用Pymol 軟件對結果進行可視化。

2 結果

2.1 參萸養心膠囊有效成分和預測靶點

通過TCMSP數據庫，篩選得到參萸養心膠囊有效成分共102 個，其中人參22 個，丹參65 個，山茱萸20個，通過Uniprot 數據庫將靶點名稱標準化后共得到161個靶點，其中人參94個，丹參123個，山茱萸60個。

2.2 心肌纖維化靶點搜集

通過Genecards 數據庫獲得心肌纖維化相關疾病靶點3 116個，其中相關性評分≥10的靶點406個。

2.3 參萸養心膠囊治療心肌纖維化的潛在靶點篩選

將上述2.1 項得到的藥物靶點和2.2 項相關性評分≥10 的疾病靶點通過Venny 圖進行映射得到交集靶點共43個，即為參萸養心膠囊治療心肌纖維化的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 參萸養心膠囊與心肌纖維化交集靶點韋恩圖Figure 1 Wayne diagram of intersection target of Shenyu Yangxin capsule and myocardial fibrosis

2.4 PPI構建和核心成分及靶點篩選

將上述43個潛在作用靶點上傳至String數據平臺行蛋白互作分析，設置“homo sapiens”“minimum re?quired interaction score ≥0.7”，隱藏6個孤立蛋白靶點F7、SCN5A、DPP4、TYR、SLC6A4、NR3C2 后，下載TSV格式蛋白互作關系文件導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建PPI，見圖2。利用該軟件CytoHubb 插件進行網絡拓撲分析，根據互作網絡中節點的節點度（degree），以其43個交集靶點的中位數及以上為核心靶點，共22 個，見表1。設排名前五位為TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3，設它們為重要靶點，再利用Cytoscape 3.7.2軟件構建參萸養心膠囊治療心肌纖維化“藥物-成分-核心靶點-疾病”網絡圖，見圖3。通過CytoNCA 插件分析圖2，根據Degree排名前10的活性成分，如表2所示，前五位為木犀草素（luteolin，Degree=14.0）、山奈酚（kaempferol，Degree=9.0）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，Degree=7.0）、丹參酮IIA（tanshinone iia，Degree=6.0）、人參皂甙Rh2（ginsenoside rh2，Degree=6.0），設它們為重要成分。

圖3 “藥物-成分-核心靶點-疾病”圖Figure 3 “drug ingredient core target disease”diagram

表1 依據“PPI”中Degree參數排列前22個靶點為核心靶點Table 1 The top 22 targets are the core targets according to the degree parameter in“PPI”

表2 “藥物-成分-核心靶點-疾病”網絡關系圖中中藥成分“Degree”前十位Table 2 The top ten of ingredient""degree""in""drug ingredient core target disease""network relationship diagram

圖2 交集靶點蛋白互作關系圖（PPI）Figure 2 Diagram of intersection target protein interaction（PPI）

2.5 核心靶點富集分析

使用核心靶點導入DAVID 數據庫分析，以P <0.05為準，確定GO條目174個，包括239條生物學過程（Biological process，BP），主要涉及RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、基因表達正調控、凋亡過程的負調控等；18條細胞成分（Cell component，CC），主要涉及細胞質、細胞外空間、細胞外區域等；17條分子功能（Molec?ular function，MF），主要涉及蛋白質結合、細胞因子活性、相同的蛋白質結合等。均取富集基因數排名前10條作圖，見圖4。

圖4 核心靶點GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of core targets

核心靶點通過DAVID 數據庫分析，共得到74 條（P<0.05）KEGG 富集通路，按富集基因數目排序取前20 條信號通路展示，見表3 和圖5。分析可知依次是TNF信號通路、結核病、癌癥的途徑、弓形蟲病、乙型肝炎、炎癥性腸病、利什曼病、南美錐蟲病（美國錐蟲病）、甲型流感、癌癥中的蛋白聚糖、瘧疾、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、麻疹、單純皰疹感染、MAPK信號通路、非洲錐蟲病、胰腺癌、百日咳、類風濕關節炎。

圖5 點KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway enrichment analysis

表3 KEGG通路富集分析前20條參數Table 3 The top 20 parameters of EKGG Pathway enrichment analysis

2.6 關鍵藥物成分-靶點分子對接驗證分析

參萸養心膠囊中Degree排名前三為關鍵成分和靶點，關鍵成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與關鍵靶點TNF、IL6、IL1B 進行分子對接驗證。一般認為小于-7.0 kcal/mol-1表示有強烈的結合活性[8]。關鍵成分的分子結構，見圖6。分子對接結果參數見表4。可視化結果展示，見圖7。

表4 關鍵藥物成分-關鍵靶點分子對接參數Table 4 Key drug components-key target molecular docking parameters

圖6 關鍵成分的分子結構Figure 6 molecular structures of key components

圖7 關鍵成分-關鍵靶點分子對接模式圖Figure 7 Diagram of molecular docking mode of key components key targets

3 討論

本研究篩選出參萸養心膠囊共102 種成分，其中五種重要成分為木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹參酮IIA、人參皂甙Rh2。木犀草素是丹參的主要成分。成纖維化細胞過度增殖分化是心肌纖維化的主要病理表現，WANG T 等[9]在大鼠成纖維細胞實驗中證實，木犀草素可以拮抗血管緊張素II刺激成纖維細胞增殖和膠原的合成，山奈酚屬于黃酮類化合物，是人參的重要成分。DU Y等[10]實驗證實山奈酚可以通過減輕血管緊張素II誘導小鼠心臟的炎癥和氧化應激來減少心肌纖維化和心功能障礙。β-谷甾醇是山茱萸和人參的重要成分，WONG HS等[11]發現β-谷甾醇通過線粒體呼吸產生活性氧增強細胞谷胱甘肽氧化還原循環來保護H9c2細胞和大鼠心臟免受氧化應激的損傷，從而保護了心功能。丹參酮IIA是丹參的重要成分，ZHANG Y等[12]在小鼠成纖維細胞實驗中證實丹參酮IIA通過抑制β-微管蛋白表達來預防心臟纖維化。人參皂甙Rh2 是人參所含成分，LO SH等[13]在細胞及Ⅰ型糖尿病模型大鼠實驗中發現人參皂苷Rh2通過激活PPARδ抑制STAT3信號，最終使心臟纖維化明顯改善。由上討論可見，篩選的參萸養心膠囊重要成分對抗心肌纖維化具有重要作用。

參萸養心膠囊治療心肌纖維化的交集靶點43個，核心靶點22 個，5 個關鍵靶點為TNF、IL6、IL1B、VEG?FA、STAT3。IL6、TNF 為多效應的細胞因子，與炎癥密切相關。FANG L 等[14]研究發現與空白對照組相比，肥厚性心肌病的患者TNF、IL6 水平顯著升高，IL-6 與區域纖維化相關。血管緊張素II 是心臟心肌纖維化和心肌肥大重要的致病因素。DUERRSCHMID C等[15]在細胞及小鼠體內實驗證實TNF受體1信號傳導是血管緊張素II誘導的心臟纖維化的關鍵因素。IL-1β是心臟病中的關鍵炎癥誘導劑，BR?NNUM H 等[16]細胞實驗發現IL-1β的增加抑制了TGF-β1 介導的心肌成纖維細胞分化、增殖，從而減輕了心肌纖維化程度。VEGFA是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用，TAO H 等[17]實驗證實Mi?croRNA-29a 通過靶向VEGFA/MAPK 信號通路抑制心臟成纖維細胞增殖，減輕心肌纖維化。STAT3是信號傳導與轉錄激活因子蛋白家族的一員，可以被不同細胞因子受體激活的蛋白，近年研究表明STAT3 的激活可以通過如協同NF-κB作用[18]，增強Notch-1信號[19]等多種途徑對心肌纖維化產生重要影響。由上討論可見，篩選的參萸養心膠囊重要靶點對抗心肌纖維化具有重要作用。

分子對接結果顯示參萸養心膠囊中3個關鍵成分木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇與3 個關鍵靶點TNF、IL6、IL1B 結合能均小于—7.0 kcal·mol-1，表明它們具有強烈的結合活性，從而在理論上驗證了參萸養心膠囊可能通過上述成分和靶點抗心肌纖維化。

GO 富集分析顯示參萸養心膠囊治療心肌纖維化主要在RNA 聚合酶II啟動子轉錄的正調控、基因表達正調控、凋亡過程的負調控等方面起作用。根據KEGG富集分析前20 項結果和近年研究報道：TNF 通路涉及炎癥及參與導致心肌纖維化的聯級反應[20-22]；激活HIF-1α信號通路可增強血管緊張素II誘導心臟纖維化作用[23]；通過增強MAPK 通路致心肌纖維化報道亦甚多[24-26]。表明參萸養心膠囊可能作用于上述多通路途徑來抗心肌纖維化。

4 結論

篩選參萸養心膠囊所含的五個重要成分和靶點，且分子對接理論上驗證了木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇和TNF、IL6、IL1B相互具有強烈的結合力，故參萸養心膠囊治療心衰的良好效果，可能源于以木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、丹參酮IIA、人參皂甙Rh2等為代表的多成分，以TNF、IL6、IL1B、VEGFA、STAT3等為代表的核心靶點，以TNF、HIF-1α、MAPK 通路等為代表的多通路，多方面起到協同抗心肌纖維化的作用。本研究為后續的臨床與實驗研究奠定了一定的理論基礎，具有重要的指導意義。

（利益沖突：無）