核磁共振技術在藥物檢測中的應用進展

劉雅琴，余明新，何 玲

浙江大學化學系，杭州 310027

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波譜是一種基于特定原子核在外磁場中吸收與其裂分能級間能量差相對應的射頻場能量而產生共振現象的分析方法。1946年由美國物理學家Purcell和Bloch等[1-3]闡明磁共振現象并共同獲得諾貝爾物理獎。在早期的研究中，藥物結構的確定主要通過各種化學反應，如制備衍生物、化學降解、顏色反應等方式來完成，主要獲得官能團但無法確定全部結構，一個復雜分子的結構鑒定甚至花費幾十年的努力。近些年，對于難以結晶的分子，晶體海綿法、冷凍電鏡等技術相繼被開發用于分子結構測定，但是對于無定形及低晶格能的非結晶分子，上述方法仍然捉襟見肘，難于應付。隨著波譜學技術的發展和廣泛應用，對藥物的研究取得顯著進展，核磁共振成為最實用、最全面的分析方法，其精確構象分析是單晶衍射與電鏡所無法比擬。與其它分析方法相比較，核磁共振的優點有以下幾種：①提供豐富且精確的結構信息，由拉莫爾頻率獲知原子核；化學位移推出官能團；自旋-自旋-偶合得出原子的相關性；偶極偶合獲得空間位置關系；弛豫現象用于動力學研究。②簡便性，藥物不需要進行繁雜的前處理過程，可避免處理過程中的誤差，且分析時間短。③無損傷性，在樣品量非常有限的情況下，在對其進行核磁分析后，沒有任何的損壞和浪費，性質不發生改變，還可以進行再使用。特別是二維核磁共振的發展使其成為化學結構研究的極為重要工具，同時也打開了通向藥學、生物醫學研究的新窗口，在細節上揭示了結構和功能的關系。對于一維譜信號重疊嚴重、無法準確歸屬，難以解析的情況，需要借助二維核磁共振譜技術來解決。通過COSY或TOCSY譜確定分子中各個位置的質子；在HSQC譜上通過質子找到對應的碳信號；用HMBC譜確認信號的歸屬，并解析碳與質子的連接位置及連接順序等。核磁共振波譜正響應現代藥物開發需要，提供藥物相互作用的信息、特定的分子靶點和藥理作用位點。隨著核磁共振儀器硬件和脈沖方法的不斷發展，加之其多功能性，它成為結構研究特別是藥物研究的重要工具。核磁共振可提供一套多功能的實驗方法，為藥物發現提供了重要信息，從合成產物的表征、天然產物的開發到生物系統分子結構的研究。本文主要綜述NMR技術應用于藥物檢測及其相關研究進展。

1 NMR波譜在藥物發現中的應用

核磁共振波譜廣泛用于藥物分析以識別藥物及其雜質，該技術非常適用于活性藥物成分(API)的質量評估[13-15]，定量核磁共振在藥物分析中可用于確定雜質水平并闡明其結構以及評估殘留溶劑的含量[16,17]。它可以通過手性添加劑測定異構體組成，即非對映體和對映體過量的比率[18-21]。利用NMR可以提供許多重要的結構信息，各種不同原子可產生不同的磁共振波譜，如1H、13C、7Li、19F、31P、77Se等。2020年Oriol等[22]為了在實驗上評估鉍介導的含氟有機硼化物中間體的形成，通過1H、11B、19F和13C核磁共振證實了含氟有機硼的形成。Geeson等[23]報道了用于生產高純度硅的三氯氫硅，將三偏磷酸還原為一種新型的二(三氯氫硅基)磷化陰離子，通過29Si和31P核磁共振的特征對其結構進行分析。Binas[24]最新觀點認為RNA也成為了藥物發現的潛在靶點，他報道用19F-NMR作為先導物鑒定的主要方法，對14種不同大小、不同結構的RNA進行102個片段文庫的篩選。Zhou等[25]為了推斷一種新型含硒柱芳烴具有可逆的氧化還原反應性，使用77Se NMR波譜研究硒化物和硒氧化物之間的可逆轉化。柱芳烴含有硒氧化物部分，在77Se NMR中顯示化學位移δ為865.85，被維生素C還原后其化學位移δ變為269.39，表明硒氧化物部分轉化為硒化物基團；添加過氧化氫后化學位移變回865.85。Tan等[26]利用NMR中的擴散序列譜(diffusion ordered spectroscopy，DOSY)對生物膜加入親水高分子后兩個反應物進行虛擬分離，測定擴散速率差，如圖1所示，均勻分散的水-表面活性劑(AOT)-癸烷(decane)多相系統中各組分的擴散系數通過核磁共振測量獲得,在該系統中水分子的運動被限定在納米水滴中。因此，測量所得的水的擴散速率不是單個分子的自擴散系數，而是納米水滴的擴散系數。由于水分子的運動被限定在納米水滴中，其擴散系數遠小于自由狀態下單個水分子的擴散系數。從二維的擴散排序核磁共振譜(2D DOSY NMR)中可看出，作為分散相的納米水滴的擴散系數在7×10-7m2/s之間，而連續相中癸烷分子的擴散系數在4×10-5m2/s左右，驗證了成功制備一種具有圖靈結構的新型生物膜?？梢?，核磁共振中各種不同類型譜圖的發展推動著NMR在藥物發現環節更加廣泛的應用。

圖1 核磁共振DOSY譜表征生物膜的圖靈結構Fig.1 Turing structure of biofilm by DOSY NMR

研究顯示NMR波譜技術在藥物高通量篩選(high throughput screening，HTS)[27-29]和基于結構的藥物發現[30-32]方面已發展成為新療法發現過程背后的驅動力[33]。核磁共振作為主要的分析工具用于確定合成和天然產品化學先導物的化學結構和組成[34,35]。核磁共振高通量配體篩選通常成為驗證和識別新化學線索[36,37]；采用基于片段的方法意味著通過核磁共振快速篩選小型化學庫可以實現結構空間探索的指數增長，遠遠超過傳統的HTS方法[38]。

天然產物是藥物發現的一個重要來源，特別是隨著核磁共振方法的靈敏度和分辨率的提高，同時通過NMR與HPLC聯用使得快速獲得天然產物結構信息成為現實。HPLC-NMR是高效液相色譜(HPLC)和核磁共振(NMR)聯用系統，是一種高效的技術，對于復雜樣品可以更好地進行快速的分離鑒定，應用于天然產物分析、代謝產物分析、藥物雜質分析、結構鑒定等領域[39]。HPLC-NMR的主要缺點是其低靈敏度，但可通過引入超低溫探頭和增加磁場強度加以克服。Li等[40]從植物內生真菌Fusariumguttiforme次生代謝產物中分離純化得到7種化合物，并通過核磁共振等波譜學手段鑒定其結構。Lever等[41]使用HPLC-NMR在海洋褐藻中的提取物中，找到4種未報道的化合物和8種已經報道的化合物，其中5種化合物具有選擇抗菌活性。由于海洋生物活性物質具有結構復雜且含量極微的特性，LC-NMR的聯用展現了無法比擬的在線檢測和結構解析的鑒定能力，極大地簡化了分析過程，較好地實現了天然產物樣品的在線結構分析。

2 NMR波譜在藥物相互作用中的應用

在藥物研究中，NMR是研究配體及其靶點相互作用非常重要的一個工具。核磁共振確定化學結構的實驗依賴于磁化信號通過共價鍵或空間(構象)從一個原子核轉移到另一個原子核。此外，每個原子核固有的弛豫速率，可以通過調節分子的NMR譜來測量，根據實驗的不同，可能是構象交換、化學交換、局部或全局動力學，也可能是分子的整體旋轉和平移擴散。核磁共振技術的主要優點之一是能夠獲得相對簡單的波譜，能夠直接識別潛在配體混合物中的弱結合成分，識別配體的結合表位以及識別目標蛋白質中的結合口袋，從而了解分子中單個核的環境；人們可以利用這些相同的優勢來測量小分子與其靶點的結合。小分子在溶液中很快地重新定向和擴散產生尖銳且分辨率良好的共振，而大分子在溶液中更緩慢地重新定向和擴散產生廣泛且分辨率較低的信號。Garavis等[42]基于19F NMR片段的篩選，使用355個片段文庫對G-四鏈體RNA確定了幾個對其他核酸靶點具有選擇性的片段。NMR還被用于證明一些小分子與HIV反式激活反應元件(transactivation response element，TAR)的結合穩定了低填充激發態，強調了動力學在核酸中的重要作用[42-45]。

通過核磁共振波譜研究配體-目標結合相互作用有兩種主要方法[46,47]：配體觀察法和目標觀察法。前者依賴于配體NMR信號中的結合誘導變化，傳統上由飽和轉移差譜NMR(saturation transfer difference NMR,STD NMR)實驗表示，另一方面，目標觀察方法研究同位素標記目標中的結合誘導信號變化，異核單量子相關譜(heteronuclear single quantum coherence，HSQC)最能代表這個類別，它提供了常用的配體和靶點觀察技術的信息。實驗方法和標記方案的改進以及最新的生物學發現將繼續激發人們對新的藥物靶點的興趣。STD NMR譜是最靈敏的檢測配體結合的實驗，如圖2所示[12]，采用STDNMR實驗觀測配體與蛋白結合的行為，(a)結合配體(藍色)在束縛態和自由態之間進行緩慢翻轉處于平衡狀態，而非結合配體(紅色)不受目標存在的影響。(b)核磁共振氫譜顯示了結合和非結合配體的信號。(c)對于結合配體，NMR信號變寬，而對于非結合配體，信號不受影響。(d)在STD-NMR實驗中，利用一系列選擇性脈沖使蛋白質飽和擴散到靶區，最終通過結合平衡轉移到自由配體。(e)STD-NMR譜僅反映屬于結合配體的信號，而未觀察到來自非結合配體的信號。(f)在WaterLOGSY(Water-ligand observed via gradient)實驗中，樣品利用水分子通過NOE選擇性轉移使得結合配體的信號與非結合配體的信號相反。(g)WaterLOGSY譜顯示非結合配體與相關的結合配體的信號正好反向。該研究揭示了通過NMR觀察生物分子的溶液行為可以獲得有關其結構、動力學和相互作用的信息，這對于配體與靶點相互作用的新穎識別至關重要。

圖2 利用STD NMR實驗觀測配體的結合行為Fig.2 The binding behavior of ligands was observed using STD NMR experiment

3 核磁共振技術在藥物代謝組學中的應用

磁共振波譜可作為藥物治療反應評估的定量方法，能提供溶液里藥物代謝組學的結構信息，如原子水平上的修飾位點、區域和立體異構體特征、動態物理性質以及如何測量這些參數[48,49]。事實上，該技術已經應用于不同領域的代謝物的無創體內分析，例如癌癥中一些內源性代謝物的31P、13C、19F和1H磁共振波譜[50-52]信號可以被觀察到。例如，19F NMR已經成功地應用于評估氟化藥物的藥代動力學[53]。根據時間過程，這些測定與二維和更高維方法相結合以區分藥物信號與不可避免的重疊共振，并獲得更多信息，當然這些例子基本上僅限于高濃度給藥的癌癥治療藥物。一般來說核磁共振波譜在藥理學研究中的作用是研究藥物對組織形態、生理學和生物化學的影響，而不是研究藥物本身在機體中的去向[54,55]。可見，核磁共振是一種無損地表征多種元素的重要方法。

氫核磁共振波譜已成功應用于心力衰竭患者的可靠診斷方法。Kang等[56]從尿苷1H NMR測量中獲得代謝產物抑制了酮體水平的增加，同時降低了三羧酸循環中間產物的水平，表明能量代謝改變，包括三羧酸循環和脂肪酸代謝的改變，這些是通過樣品的氫譜在規定化學位移處出現特征峰信號的方法進行鑒別。觀察到涉及甲基丙二酸和核苷酸代謝的代謝途徑中的擾動。1H NMR光譜已經成為植物代謝信息處理的一項強有力的技術，主要是因為與其他分析技術相比，該技術對樣品需求量小，無破壞性，定量準確。核磁共振波譜將繼續成為藥物代謝產物結構闡明工具的重要組成部分，它提供的信息類型與從藥物代謝工作中使用的主要分析工具HPLC-MS獲得的信息可完美互補[57]。

4 固態核磁共振技術在固態藥物分析中的應用

固態核磁共振(solid state nuclear magnetic resonance，ssNMR)在宏觀和微觀尺度上獲得的分子特性為藥物和藥物產品的物理化學穩定性提供了關鍵信息，能夠確定藥物作為純物質或在配方產品中的狀態，而無需從配方中提取。該藥物通常表現出與賦形劑不同的共振，從而有可能在制劑中識別藥物。定量碳譜交叉極化魔角旋轉(cross polarisation-magic angle spinning，CP-MAS)固態核磁共振方法已廣泛用于量化原料藥和固體劑量中的多晶型和形態轉化百分比。13C-CP-MAS NMR可以量化物理混合物中API多晶型、水合物、溶劑化物、鹽和無定形形式的相對數量[58-60]。Kumar等[61]采用固態核磁共振技術研究一組抗癌藥物(5-氟尿嘧啶、阿霉素和柔紅霉素)在ZnO納米粒上的吸附行為，ssNMR數據闡述了自由和氧化鋅表面吸附藥物樣品的13C CP-MAS NMR譜顯示出明顯的譜線展寬和化學位移變化，表明了可能的吸附模式。弛豫測量證實了ZnO表面5-氟尿嘧啶的剛性結構和動力學特性的變化，它證明了固態核磁共振波譜在獲取基于納米顆粒的詳細結構和動力學信息方面的有效性和針對性。

魔角旋轉固態核磁共振波譜也可用于闡明脂膜中功能重要的蛋白質-配體相互作用。固態核磁共振方法[62]包括多核檢測以獲得全面的結構信息，距離測量以定位配體結合位點以及動態核極化和1H檢測以提高光譜靈敏度。固態核磁共振波譜技術最近用于表征酶與藥物復合物的結構生物學研究，Vasa等[63]展示了一個29 kDa碳酸酐酶乙酰唑胺復合物，非氘化的500 μm樣品通過固態核磁共振波譜技術，獲得蛋白質結構、蛋白質動力學以及氨基酸側鏈中的生化參數。因此，這些研究為蛋白質-配體相互作用、跨膜信號、底物轉運、抗菌作用和許多其他生物過程的機制提供了新的見解和前期的研究基礎。特別的是，高靜態場強、基于同核雙極解耦序列的實驗以及基于動態核極化(DNP)的實驗，在固體藥物材料中得到了越來越多的應用。

5 結語與展望

近三十多年來，核磁共振技術的發展促使了藥物研究速度顯著加快，它可獲得無與倫比的結構信息，成為結構解析的“金標準”。雖然HPLC-MS可以在有利條件下檢測給定分析物至飛摩爾級別，但即使是最現代的核磁共振設備也需要在合理時間內使用數納摩爾的樣品進行分析。實際上，所有現代高分辨率核磁共振光譜儀都是脈沖傅里葉變換儀器，可同時激發給定類型的所有原子核，并以自由感應衰變的形式收集原始數據，這使得將多個自由感應衰變瞬態相加以提高頻譜信噪比成為可能，因此，低靈敏度一直是(并將繼續是)核磁共振生物分析應用的致命弱點，而提高核磁共振靈敏度一直是過去四十年來大多數技術發展的焦點。目前，全球首個1.2 GHz最高磁場在瑞士聯邦理工學院安裝，預計未來將逐漸出現更多大于1 GHz的NMR譜儀，通過提高磁體的磁場強度將使藥物大分子的結構研究有重大突破。隨著核磁共振譜在生物大分子結構分析中的應用，核磁共振技術所提供的結構信息的數量和復雜性呈幾何級數增加，將發展三維核磁共振技術。對三維空間的構象和大分子與小分子之間的相互作用等，二維核磁共振已顯得無能為力，因此要發展分子建模技術，利用NOE所提供的分子中質子間的距離信息來計算三維空間結構。同時也將提高核磁共振信號的內在敏感性和35 kDa以上生物分子固有的廣泛和重疊信號的分辨率，我們期望核磁共振能繼續為藥物領域的研究做出貢獻。特別是固態核磁共振的發展，可提供獨特和全面的視角，其固有的定量性質、區分單個化學品的高靈敏度、闡明局部結構和復雜相互作用的原子分辨率、探測非晶態材料的分子填料的能力以及在不同時間尺度上研究分子運動的能力，使核磁共振成為更加有力的分析工具。在未來，核磁共振可能與其他分析技術(如質譜和X射線晶體學)結合使用，便于更快地控制、更好的動態范圍以及更大的靈活性和可擴展性，提供最領先的結構分析方法。