基于數據挖掘和網絡藥理學研究強直性脊柱炎的用藥規律及高頻藥物組合的分子作用機制

姜 平，何東儀*

1上海中醫藥大學光華臨床醫學院，上海 201203；2上海中醫藥大學附屬光華醫院風濕免疫科，上海 200050

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種病因不明的慢性炎癥性疾病。與其他系統性自身免疫性疾病不同，先天免疫系統和免疫細胞的異常活動起主導作用[1]。在疾病發展過程中，AS易累及骶髂關節和中軸骨部位，最常見的癥狀是慢性背痛和脊柱僵硬，但外周和肌肉骨骼外的表現也很常見[2]。在治療上，非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)仍然是一線藥物治療。作為二線藥物，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)抑制劑和白細胞介素-17(interleukin 17，IL-17)抑制劑是可用的[3]。而最近Janus激酶抑制劑也顯示出改善疾病癥狀的效果[4,5]。雖然這些生物制劑在AS治療上顯示出良好的效果，但同時也存在許多不良反應。中醫藥傳承幾千年，有其自身獨特的治療優勢。中醫藥專家一直致力于對AS治療的不懈追求中，中醫藥在改善AS癥狀以及提高遠期療效方面有著獨特的優勢。上海中醫藥大學附屬光華醫院為三級甲等關節病專科醫院，年門診23萬余人次，年出院6 800余人次，床位153張，是國內最大的風濕科之一，具有一定的研究優勢。由于中醫學為經驗醫學，且流派較多，在治療AS疾病上用藥無統一標準，中醫藥方又多為自擬方，缺乏現代藥理學研究。因此，筆者采用數據挖掘技術[6]，探索院內風濕免疫科醫師運用中藥治療AS的處方用藥規律，分析出高頻率使用的單味中藥、藥對以及高頻率藥物的四氣五味、功效分類和歸經規律等，并挖掘出新的藥方，同時結合中藥藥理學分析，進一步闡釋中藥治療AS的分子作用機制，從而為中醫藥治療AS疾病提供一定的理論基礎和指導。

1 資料與方法

1.1 中藥處方來源

本研究所需中藥處方均來自上海中醫藥大學附屬光華醫院風濕免疫科門診及住院部，患者就診時間限定為2021年4月至2022年2月。

1.2 數據篩選

病種為強直性脊柱炎，中藥處方數據完整且配伍合理。

1.3 數據錄入

數據錄入采用“人工雙錄入模式”，即1人錄入、另1人核對，將篩選后符合條件的處方錄入Excel 2019表格中。數據錄入時以2020版《中國藥典》[7]為參考標準來規范中藥名稱，并同時錄入中藥的藥味、藥性、歸經和功效。

1.4 數據分析

用Excel 2019數據透視表統計中藥的藥味、藥性、歸經和功效分類。用SPSS Modeler 18.0及SPSS Statistics 20.0軟件對高頻中藥進行關聯規則和系統聚類分析，得到高頻藥物組合并進行可視化展示。

1.5 狗脊-續斷成分和作用蛋白獲取

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP數據庫)和本草組鑒數據庫(http://herb.ac.cn/)獲取狗脊-續斷的化學成分，根據化學成分的藥動學參數(ADME)，按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18對其進行活性成分篩選，然后獲取相應的成分作用蛋白，并利用Uniprot數據庫對獲得的基因蛋白進行名標準化處理。

1.6 AS疾病基因的獲取及藥物-疾病核心基因的篩選

在疾病相關數據庫(GeneCards、TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM)中分別以“ankylosing spondylitis”為關鍵詞檢索與AS相關的靶基因，限制靶基因物種類型為人類。然后對藥物基因與疾病基因之間進行交集，交集基因通過String數據進行蛋白互作分析，并將結果導入Cytoscape 3.7.2中進行優化。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析

將交集基因進行GO生物過程分析和KEGG通路分析，結果得到相應的生物過程(biological processes，BP)、細胞成分(cellular components，CC)、分子功能(molecular functions，MF)條目和KEGG通路，以P≤0.05為篩選標準，選出每個項目中符合條件的前10位。

2 結果

2.1 中藥頻次統計

本研究共納入符合條件的處方200個，涉及中藥236味，藥物未被《中國藥典》記錄者，則不納入統計。本研究共統計中藥236味，總頻次3 232次，其中使用頻率≥1%的有狗脊、白術、獨活、當歸、續斷等28味中藥(見表1)。這些中藥累計頻次1 742次，占總頻次的53.90%，屬于高頻率使用中藥。

表1 頻率≥1%的中藥統計表Table 1 Statistical table of TCM with frequency≥1%

2.2 藥味、藥性、歸經及功效分類統計

對236味中藥進行分析，結果發現：在藥味分析中，苦、甘、辛三味居前三位，累計頻率為85.68%；在藥性分析中，溫、平、寒三性為主，累計頻率為73.31%；在藥物歸經分析中，主要歸于肝、肺、脾、胃、腎經，累計頻率為76.91%；在藥物功效分析中，補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥、解表藥和祛風濕藥為常用藥(見表2、表3)。

表2 中藥藥味、藥性及歸經統計表Table 2 Statistical table of TCM's taste,property and channel tropism

表3 中藥功效分類統計表Table 3 Statistical table of TCM with efficacy

2.3 中藥聚類分析

將使用頻率≥1%的28味中藥運用SPSS Statistics 20.0軟件采用平均聯接(組間)和Pearson相關性進行系統聚類分析，生成樹狀聚類圖(見圖1)。在中醫理論指導下，以類間距為21，將藥物分為6類。Ⅰ類：蒼術、黃柏、綿萆薢、薏苡仁、丹參；Ⅱ類：狗脊、續斷、獨活、威靈仙、莪術、炙甘草；Ⅲ類：伸筋草、木瓜、槲寄生、羌活、白術、黃芪、雞血藤、延胡索；Ⅳ類：茯苓、陳皮、山藥；Ⅴ類：甘草、牛膝、白芍；Ⅵ類：當歸、川芎、杜仲。

圖1 藥物聚類圖Fig.1 Clustering diagram of TCM

2.4 中藥關聯規則分析

運用SPSS Modeler 18.0軟件對高頻中藥進行關聯規則分析，設置“弱鏈接上限”為20，“強鏈接下限”為35，結果得到頻數≥40的藥物組合33個(見表4)。按頻數排名前10位的藥物組合(強鏈接組合)依次是狗脊-續斷、獨活-狗脊、白術-狗脊、獨活-續斷、白術-獨活、白術-黃芪、白術-續斷、川芎-當歸、白術-當歸、當歸-狗脊。藥物間的關聯通過網絡圖進行展示(見圖2)。然后利用Apriori建模進一步挖掘藥物之間的配伍關系，設置支持度為10%，置信度為90%，調整最大前項數為5，分析挖掘出潛在藥物組合。按照支持度排名，結果得到10個核心藥物組合(見表5)。其中獨活、狗脊、續斷、白術在多個藥物組合中頻繁出現，因此是中藥關聯規則網絡的核心藥物。

表4 頻數≥40的藥物組合Table 4 Drug combinations with count≥40

圖2 藥物關聯網絡圖Fig.2 Drug association of network diagram

表5 中藥關聯規則分析Table 5 Analysis of association rules of TCM

2.5 中藥因子分析

應用SPSS Statistics 20.0軟件對高頻中藥(使用頻率≥1%)進行因子分析，結果顯示KMO值為0.692>0.5，Bartlett球形度檢驗值為378，且P值<0.01，表明本數據具有較好的線性關系，可進行因子分析。在方法中選擇最大方差法旋轉分析，結果得到8個公因子，其累積方差貢獻率為65.302%。由碎石圖(見圖3)可以看出，從第8因子之后，線條趨勢趨于平緩。經過因子分析，形成高頻中藥的旋轉成分矩陣表(見表6)。之后根據旋轉成分信息表提取藥物因子分析組合(見表7)，最后產生因子分析圖(見圖4)。

圖3 中藥因子分析碎石圖Fig.3 Lithotripsy by factor analysis of TCM

表6 高頻中藥的旋轉成分矩陣表Table 6 Rotational component matrix of high frequency TCM

表7 因子分析組合Table 7 Combination of factor analysis

圖4 中藥因子分析旋轉空間成分圖Fig.4 Rotation space component diagram of factor analysis

2.6 新藥物組合

綜合上述研究結果，最終可以形成以“狗脊-續斷”為核心的新配伍藥物組合，包括組合1：狗脊、續斷、獨活、威靈仙、莪術、炙甘草；組合2：狗脊、續斷、白術、獨活；組合3：狗脊、獨活、續斷、槲寄生。這些新藥物組合有利于指導AS的臨床治療，之后的研究課題將對這些藥物組合進行深層次的分子作用機制研究和實驗驗證。

2.7 狗脊-續斷的成分和作用蛋白

根據第一部分數據挖掘結果，狗脊-續斷藥物組合使用頻率最高，運用網絡藥理學方法進一步分析狗脊-續斷治療AS的具體作用機制。通過數據庫篩選，結果獲得狗脊-續斷的有效成分12個(見表8)，獲取基因430個。

2.8 疾病基因的獲取和核心基因的篩選

共獲得疾病基因2 465個，藥物與疾病間的交集基因125個(見圖5)，交集基因的PPI分析結果顯示TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2、MMP2、MMP9、IL2等為主要作用蛋白(見圖6)。

2.9 GO和KEGG分析結果

GO分析結果顯示BP主要包括炎癥調控反應(inflammatory response)和藥物反應(response to drug)等過程；CC主要包括谷氨酸能突觸(glutamatergic synapse)和內吞溶酶體(endolysosome)等結構；MF主要包括核受體活性(nuclear receptor activity)和配體激活的轉錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)等功能(見圖7)。KEGG通路主要包括：癌癥通路(pathways in cancer)、Toll樣受體信號通路(toll-like receptor signaling pathway)、神經營養素信號通路(neurotrophin signaling pathway)和T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)等(見圖8)，表明狗脊-續斷可能通過上述通路作用于AS。并將富集在通路上的基因進行可視化分析，繪制基因-通路關聯網絡圖(見圖9)。從圖9可知，一條KEGG通路可以富集到多個基因，而一個基因又可以同時出現在多條通路上，表明狗脊-續斷是通過多成分、多靶點、多通路來治療AS疾病。

表8 狗脊-續斷活性成分Table 8 Active components of RC-RD

圖5 交集基因Fig.5 Intersection genes

圖6 互作分析Fig.6 Interaction analysis

圖7 GO結果分析Fig.7 Analysis of GO results

3 討論與結論

AS的病因病機目前仍無法完全解釋。現在中醫普遍認為本病在早期是以邪實為主，日久痰瘀互結，阻滯督脈，導致脊背僵硬不舒，后期出現肝腎虧虛、督脈受損，形成“早邪、中瘀、晚虛”的病理特點[8]。中醫藥治療AS歷史悠久，古代醫家的治療處方也是非常豐富。隨著現代信息技術的發展，利用網絡數據庫，我們可以發現中醫藥治療疾病的用藥規律，并總結出中藥的藥性、歸經和功效等，從中醫角度進一步研究疾病。

文章第一部分通過數據挖掘對本院治療AS的中藥處方進行收集、整理。共收集處方200個，統計中藥236味，結果發現現代醫家在治療AS上與古代醫家用藥基本相似[9]。用藥上以補虛藥、活血化瘀藥、清熱藥和祛風濕藥為主，如狗脊祛風濕、補肝腎、強筋骨，續斷補肝腎，當歸活血化瘀，獨活祛風除濕等。藥味以苦、甘、辛為主，藥性主要是溫、平、寒，走行于肝、肺、脾、胃、腎等經絡。中醫理論認為肝主筋，腎主骨藏精，脾胃主運化，為后天之本。肝、腎、脾、胃功能正常，則精血充足，筋骨得以濡養后脊柱關節才能正常活動[10]。之后對使用頻率≥1%的高頻率使用藥物進行了聚類分析。結果則劃分為6類，其中以祛風濕、活血化瘀和補腎強骨藥為主。符合AS多以肝腎虧虛，督脈受損，并伴隨久痹成瘀的病理特點[11]。關聯規則分析結果顯示出排名較高的33對藥物組合主要是補虛藥、活血化瘀藥和祛風濕藥之間相互組合。像狗脊-續斷、獨活-狗脊、川芎-當歸等，與高頻率中藥分析結果可以相互對應，證實了數據分析結果的可靠性。中藥因子分析部分，則提取了8個公因子，如CF1是清熱藥、活血化瘀藥和祛風濕藥組合，CF2是祛風濕藥、補虛藥和活血化瘀藥組合，CF3是祛風濕藥和補虛藥組合等。可以看出因子分析結果與關聯規則分析結果基本吻合，具有較高的準確性。

圖8 KEGG通路分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway

圖9 基因-通路關聯圖Fig.9 Gene-pathway association′s network

第二部分針對數據挖掘結果中發現的高頻率藥物組合狗脊-續斷進行進一步的網絡藥理學分析，闡述狗脊-續斷治療AS的具體分子作用機制。藥物成分分析發現，在狗脊-續斷治療AS中發揮主要作用的活性成分為β-谷甾醇、山奈酚和柚皮素等，具有重要的藥理作用。β-谷甾醇屬于植物甾醇類成分之一，屬于四環三萜類化合物。β-谷甾醇以其特有的生物學特性和物理化學性質被較多地應用到醫藥行業中。研究發現β-谷甾醇具有重要的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促進創傷愈合和免疫調節作用，抑制腫瘤壞死因子的聚集與釋放，主要用于心血管系統和腫瘤等疾病的治療[12,13]。此外，也有研究發現，山奈酚也具有抗炎、抗細菌病毒感染和免疫調節的作用。它能夠能增強調節性T細胞的抑制功能，提高FOXP3的表達水平，并能預防和治療AS等炎癥性疾病[14]。通過藥理學分析可以發現，在狗脊-續斷中存在多種具有抗炎、抗氧化和免疫調節作用的活性成分，這些成分是狗脊-續斷發揮治療AS作用的關鍵成分。每個藥物成分都有自己的目標作用蛋白，為進一步闡述兩者之間的關系，將成分與基因進行網絡分析，得到了TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2、MMP2、MMP9、IL2等多個主要作用蛋白。像TNF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中作用機制目前已經有很多報道，相關治療藥物也已經應用于臨床治療，且具有較好的療效[15,16]。PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶,既是一種雙加氧酶又是一種過氧化物酶。它常常參與機體的各種炎癥反應，具有抑制炎癥因子分泌和抗炎、鎮痛的作用[17,18]。此外，對EGFR[19]、STAT3[20,21]等基因的研究也有很多，不再詳細闡述。綜上分析，可以發現TNF、EGFR、VEGFA、STAT3、HSP90AA1、PTGS2等基因是狗脊-續斷作用于AS的關鍵基因。后續的通路富集分析發現，這些關鍵基因主要富集在Toll樣受體信號通路和T細胞受體信號通路等，并主要參與炎癥調控反應、核受體活性和配體激活的轉錄因子活性等進程。研究表明，Toll樣受體是免疫應答的重要啟動者，包括先天免疫應答和后天免疫應答。Toll樣受體內的基因多態性會導致某些相關的關鍵信號通路功能障礙，從而增加自身免疫性疾病的風險[22]，如調控AS的炎癥反應[23]。而T細胞在免疫反應上也發揮著重要的作用，它可以通過消除感染和腫瘤來幫助產生保護性免疫，或者通過破壞宿主細胞來調控免疫和炎癥反應。通過精確定位抗原特異性T細胞受體信號來調節T細胞反應，有可能從根本上改變自身免疫性疾病的治療策略[24]。綜上所述，狗脊-續斷中的β-谷甾醇和山柰酚等重要活性成分通過TNF、EGFR和PTGS2等基因作用于Toll樣受體信號和T細胞受體信號等通路發揮治療AS的作用，體現了中醫藥治療疾病多成分、多靶點、多通路的特點，并為應用數據挖掘的結果提供了更好的理論基礎。

文章通過應用數據挖掘和網絡藥理學方法，對上海中醫藥大學附屬光華醫院在中醫藥治療AS上的處方用藥規律進行了總結分析，發現了狗脊-續斷等常用藥物組合。并對這一藥物組合進行了分子作用機制的研究，直觀地驗證了狗脊-續斷多成分、多靶點、多通路治療AS的特點，體現了中醫藥治療疾病的獨特優勢。此外，本研究也存在一些不足之處，部分醫生開具中藥時會完全依照協定處方，使收集的處方數據存在一定的局限性。而網絡藥理學分析也只是在理論上闡述出狗脊-續斷治療AS的分子作用機制，后續還需要進一步動物實驗或細胞實驗進行驗證，從而完善研究。