基于指紋圖譜結合多成分定量分析的蟾酥藥材質量評價研究

周成美，胡晶紅,2*，任 鑫，閆慶康，楊東杰，張永清,2

1山東中醫藥大學藥學院；2山東省質量控制與中藥全產業鏈建設協同創新中心，濟南 250355； 3山東康源堂中藥飲片股份有限公司，濟寧 277600

蟾酥作為我國傳統名貴中藥，主要包含生物堿、蟾毒內酯類等多種化學成分[1]，發揮抗腫瘤、抗心肌缺血等藥理活性，但其也有一定毒性，需要嚴格控制用量[2]。山東作為蟾酥藥材的道地產區，在市場上價格昂貴，質量差異較大，甚至部分藥材具有摻入蟾皮、腺體的現象，且對蟾酥的采集和初加工環節監管不夠，缺乏對源頭藥材的質量評價。近年來，HPLC指紋圖譜和多成分含量測定多用于中藥質量研究，2020版《中國藥典》規定華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈三種成分的總量的質量分數應不少于7.0%。然而，現存的研究缺乏多指標成分和多分析手段系統性評價研究，且至今為止文獻報道蟾酥質量評價成分不夠全面。本研究在此基礎上新增8種成分，以沙蟾毒精、蟾毒靈等11種主要成分作為評價蟾酥質量的綜合指標，通過指紋圖譜對40批次蟾酥樣品進行檢測，結合相似性分析、聚類分析、主成分分析和偏最小二乘法判別分析結果對其質量進行全面評價[3-9]。

1 儀器與材料

Aglient 1260 HPLC色譜儀(美國Agilent公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山市儀器有限公司)；萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

甲醇、乙酸和乙腈為色譜級(美國賽默飛公司)；純凈水(杭州娃哈哈有限公司)。

偽異沙蟾毒精(批號Y18O9Y72597)、日蟾毒它靈(批號P17O9F72594)、沙蟾毒精(批號Y03D9Y76566)、蟾蜍它里定(批號P14J11S118458)、遠華蟾蜍精(批號Y13A9Y67875)、華蟾酥毒基(批號W27M10Z84297)、蟾毒靈(批號P27F10F81703)、脂蟾毒配基(批號C30S8G45143)、蟾毒它靈(批號P28M10F84299)、脂蟾毒精(批號P14J11S118459)、南美蟾毒精(批號C25F10G81502)，純度均大于98.0%，均購于上海源葉生物有限公司。

40批次蟾酥藥材經山東中醫藥大學藥學院張永清教授鑒定為中華大蟾蜍BufobufogargarizansCantor和黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物，藥材具體信息見表1。

表1 蟾酥樣品的基本信息Table 1 Sample information of Bufonis Venenum

續表1(Continued Tab.1)

2 方法與結果

2.1 色譜條件

安捷倫 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3 mm，2.7 μm)色譜柱；流動相為0.1%乙酸水(A)-乙腈(B)進行梯度洗脫(0～15 min，85%→72% A；15～35 min，72%→71% A；35～40 min，71%→65% A；40～50 min，65%→60% A)，柱溫30 ℃，檢測波長296 nm，流速0.5 mL/min，進樣量5 μL，自動進樣。

2.2 供試品溶液的制備

取40批蟾酥藥材粉末(過3號篩)約0.1 g，精密稱定，置于具塞離心管中，加入甲醇10 mL密封，稱重后超聲(40 kHz，100 W，60 ℃)提取60 min，放至室溫后補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取偽異沙蟾毒精、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、華蟾酥毒基、遠華蟾蜍精、脂蟾毒配基、蟾毒它靈、脂蟾毒精、日蟾毒它靈、南美蟾毒精、蟾毒靈11種對照品適量，加甲醇溶解得質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液，搖勻即得。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項確立的色譜方法連續進樣6次，以華蟾酥毒基為參照峰，分別記錄其色譜結果。結果表明各共有峰的相對峰面積RSD為0.910%～2.230%，相對保留時間RSD為0.002%～0.143%，均小于5%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項確立的色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h不同時間點進樣，分別記錄結果，得到各共有峰相對峰面積RSD為0.890%～3.905%，相對保留時間RSD為0.014%～0.714%，均小于5%。表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗

取蟾酥樣品6份(S4)，分別按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，根據“2.1”項下條件進行檢測，結果表明各共有峰相對峰面積RSD為1.060%～4.780%，相對保留時間RSD為0.002%～0.174%，均小于5%。表明方法的重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 樣品指紋圖譜及共有峰指認

取供試液(S1～S40)進樣，分別測得其色譜圖，將結果導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012年版)》，設置S1為參考圖譜，采用平均數法以及時間寬度為0.1進行多點校正和全譜峰匹配分析，得到40批蟾酥指紋圖譜共有模式及對照譜圖譜(見圖1)。在40批次蟾酥藥材的對照指紋圖譜中共標記21個共有峰，通過與混合對照品圖譜比對、查閱文獻資料共指認出 11個色譜峰(見圖2)。

圖1 40批次蟾酥樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 Overlapping HPLC fingerprints of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.5.2 相似性分析

采用相似度評價系統(2012 版)，通過參照對照圖譜對蟾酥指紋圖譜進行相關系數計算，對樣本的相似性和差異性進行分類，用相關系數評價相似度[10,11]。將蟾酥的指紋圖譜與對照圖譜對比，相似度在0.779～0.991之間(見表2)，表示不同批次蟾酥存在品質差異。

圖2 蟾酥的HPLC對照指紋圖譜(A)和混合對照品溶液的HPLC圖(B)Fig.2 HPLC comparison fingerprint (A) and mixed reference substances (B) of Bufonis Venenum注：1-偽異沙蟾毒精；2-日蟾毒它靈；7-沙蟾毒精；8-蟾蜍它里定；14-遠華蟾蜍精；16-蟾毒它靈；17-脂蟾毒精；18-南美蟾毒精；19-蟾毒靈；20-脂蟾毒配基；21-華蟾酥毒基。Note:1-Bufarenogin;2-Gamabufotalin;7-Arenobufagin;8-Bufotalidin;14-Telocinobufagin;16-Bufotalin;17-Resibufagin;18-Marinobufagin;19-Bufalin;20-Resibufogenin;21-Cinobufagin.

表2 40批次蟾酥樣品的指紋圖譜相似度評價Table 2 Similarity evaluation of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類分析(HCA)

聚類分析是為了消除藥材數據中的不對稱信息，以劃分重要性為前提，將關系更接近的研究對象整合為一類[12]，實質是將多維空間中不同位置的樣本，用多種方法測量樣本之間的距離，建立分類[13,14]。本研究運用SIMCA 13.0軟件，以40批藥材的共有峰峰面積為變量進行聚類。聚類分析可以將不同批次蟾酥藥材進行區分，結果如圖3所示，一類包括S35～S40，一類包括S29～S34，其余28批藥材為一類。

2.6.2 主成分分析(PCA)

利用SPSS 22.0軟件以蟾酥共有峰的相對峰面積為指標，對數據標準化后進行主成分分析，以特征值大于1和貢獻率大于85%為標準，提取出4個主成分，其累計方差貢獻率為91.122%，表明這4個主成分包含了21個共有成分的91.122%的信息，符合主成分分析條件(見表3)。結果顯示蟾酥主成分1特征值為13.012，方差貢獻率為61.961%，對應的載荷量較大成分有8號、7號和5號色譜峰，表明主成分1受這幾種成分影響較大，為蟾酥藥材質量評價提供依據；主成分2的特征值為2.921，方差貢獻率為13.912%，15、12和18號色譜峰載荷量較大，說明主成分2受這3個成分影響較大；主成分3和主成分4的特征值分別為1.662和1.540，方差貢獻率為7.915%和7.334%，說明4個主成分代表了原始數據的絕大部分信息，碎石圖顯示排名前4的成分直線較陡峭(見圖4)，有助于解釋變量，能夠綜合蟾酥成分的大部分信息。通過分析得到40批次蟾酥樣品中21種成分的得分圖(見圖4)和載荷圖(見圖5)。結合圖4、5來看可以將40批藥材分為3類，與聚類分析結果一致。

圖3 蟾酥樣品的聚類樹狀圖Fig.3 Custer analysis of Bufonis Venenum samples

圖4 主成分分析碎石圖Fig.4 PCA scree plot of Bufonis Venenum

圖5 主成分分析 (PCA) 得分圖Fig.5 PCA score plot of Bufonis Venenum

表3 蟾酥藥材主成分分析特征值及方差貢獻率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Bufonis Venenum

2.6.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

為進一步區分不同采集時期樣品，本研究采用偏最小二乘法判別分析建立數據模型。運用SIMCA 13.0軟件對40批蟾酥21種共有成分含量進行模式識別，將標準化的共有峰峰面積導入系統進行PLS-DA。模型驗證參數結果顯示，解釋率參數為R2X=0.752，模型區分參數為R2Y=0.999，模型預測參數為Q2=0.999，表明建立的模型合理并能做出較好的預測。分析得到PLS-DA分析得分圖(見圖6)，結果顯示與主成分分析和聚類分析結果一致。為確定貢獻程度最大的成分，變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)體現成分對數據模型的整體貢獻程度，值越大表明成分的貢獻越大，一般認為VIP>1的化合物發揮了重要作用[15]，通過VIP圖(見圖7)分析篩選出12個變量，影響大小依次為峰7、8、5、11、10、6、3、12、20、21、2和16，以上成分也是區分蟾酥藥材質量的重要成分。

2.7 多成分含量測定

2.7.1 系統適應性

分別取混合對照品和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，偽異沙蟾毒精等11種成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05(見圖1和2)。

圖6 40批蟾酥藥材偏最小二乘判別分析得分圖Fig.6 PLS-DA score plot for 40 batches of Bufonis Venenum

圖7 40批蟾酥PLS-DA 模型中11個色譜峰的VIP圖Fig.7 VIP of 21 chromatographic peaks in PLS-DA model of Bufonis Venenum

2.7.2 線性關系考察

分別精密取適量的“2.2.2”項下的混合對照品溶液，按照倍數稀釋法最終得出11種成分的線性回歸方程，結果見表4。

表4 回歸方程及相關系數Table 4 Linear equation and correlation coefficient

2.7.3 精密度考察

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項下方法進樣，連續進樣6 次，計算11 種成分的峰面積的RSD。結果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD 分別為0.30%、0.23%、0.22%、0.12%、0.31%、1.28%、0.29%、0.45%、0.24%、0.28%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩定性考察

取蟾酥供試液(S4)，按“2.1”項下方法分別在0、2、4、8、12、24h，計算11種成分的峰面積的RSD。結果偽異沙蟾毒精等11種成分峰面積RSD分別為0.58%、0.31%、0.25%、0.12%、0.41%、1.46%、3.34%、0.85%、0.48%、0.30%、0.81%，表明樣品在24h內穩定。

2.7.5 重復性考察

取蟾酥樣品(S4)6 份，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，計算11 種成分含量 RSD。結果偽異沙蟾毒精等11種成分含量RSD 分別為2.26%、1.32%、1.33%、1.33%、1.43%、1.48%、1.96%、1.78%、1.57%、1.38%、1.10%，表明方法重復性良好。

2.7.6 加樣回收率考察

取蟾酥樣品(S4)6份，約0.1g，分別按精密加入適量對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率，結果見表5，結果表明該方法的回收率良好。

表5 蟾酥回收率試驗結果(n = 6)Table 5 The results of recovery test of Bufonis Venenum (n = 6)

續表5(Continued Tab.5)

續表5(Continued Tab.5)

2.7.7 含量測定

精密稱定40批次不同采收期的蟾酥藥材粉末約0.1 g，按“2.2”項下樣品處理方法制備供試品溶液，在“2.1”項中的條件進行檢測，采用外標法計算各批次樣品中 11 種化合物的含量百分數(見表6)。對比不同批次蟾酥各成分的含量百分數結果可知，11種成分中相差較大的是偽異沙蟾毒精，平均含量百分數為0.063%，且該成分的RSD值大于50%，作者推測是因為該成分峰面積較小(檢測限和定量限分別為1.399和2.138 μg/mL)，S5批次中該成分濃度低于定量限濃度，不同批次之間含量誤差較大。此外，山東省內蟾毒靈等3種藥典規定成分總含量在7.100%～11.000%之間，均大于規定的7.0%，符合2020版《中國藥典》要求。

表6 40批次蟾酥藥材多成分含量測定 Table 6 Contend determination results of 40 batches of Bufonis Venenum

3 討論與結論

山東省為蟾酥的道地產區，據調查山東省內蟾蜍養殖戶總數多達127戶，除東營市以外各市均有分布。因養殖規模差異，蟾酥質量參差不齊，指紋圖譜與多成分定量分析相結合能準確判別出蟾酥樣品之間的質量差異，可初步作為考察商品藥材優劣的判斷標準。本研究基于蟾酥樣品中11種化學成分建立HPLC指紋圖譜，主要針對蟾酥藥材中的強心苷蟾蜍二烯羥酸內酯類成分，現代藥理學實驗研究表明這些成分具有抗腫瘤，免疫調節活性和衰減癌癥衍生疼痛的功效。

此外，對色譜峰進行相似性分析，結果顯示山東省內不同批次的蟾酥相似度大于0.900，表明山東省內不同批次的蟾酥特征成分相似度良好，但省外6批樣品相似度與其他批次相比差距較大，尤其是湖南和江蘇6批樣品相似度在0.779～0.802之間。

為進一步分析不同批次蟾酥藥材中共有峰的差異，對40批次蟾酥進行聚類、主成分和偏最小二乘法判別分析分析并對樣本進行有效區分，40批樣品可以分為3類，分類結果一致，不同批次之間蟾酥的質量存在差異，且偏最小二乘法判別分析的VIP分析得到貢獻程度最大的12個成分包含沙蟾毒精、蟾蜍它里定、脂蟾毒配基、華蟾酥毒基、日蟾毒它靈和蟾毒它靈這6種成分。

通過含量測定不同批次的40批蟾酥藥材，發現藥典規定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量最高的是濟寧微山的蟾酥，此外所有成分總含量排名最高的樣品為日照莒縣的蟾酥。山東省內的蟾酥樣品在藥典規定三種成分含量之和以及所有測量成分含量之和兩方面均高于省外蟾酥樣品，且湖南和江蘇的蟾酥樣品不符合藥典規定，由此結果可以表明山東蟾酥在質量方面有一定的優勢。山東省內蟾酥含量分析結果顯示，濟寧微山和日照莒縣的蟾酥不僅在主成分分析中得分較高，藥典規定的蟾毒靈、脂蟾毒配基和華蟾酥毒基含量較高的樣品，且此樣本所含成分總量在全部批次中也是較高的，因此作者認為這批樣品蟾酥的綜合質量最佳，造成這一結果可能與這兩地氣候條件和地理位置有關，為該地大力發展蟾蜍養殖提供理論依據。

綜上，本研究不僅建立同時測定蟾酥中11種成分指紋圖譜，還與蟾酥質量鑒定和品質評價有一定的相關性，綜合評價蟾酥的質量，為蟾酥生產過程中質量控制提供科學依據。在對蟾蜍的養殖過程中，應充分考慮蟾蜍的生存條件，采用科學嚴謹的質量控制指標，建立更為合理科學的馴養基地，提高產地經濟效益。