黃連半夏藥對治療慢性萎縮性胃炎作用機制研究

向 陽，黃 瓊，袁 林

1云南中醫藥大學，昆明 650000；2風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室；3 湖北民族大學，恩施 445000

慢性萎縮性胃炎屬于中醫學“胃痞”“胃痛”范疇，病因多由正氣不足、外邪犯胃、情志不遂、飲食失常等導致，病在脾胃，病性多虛實夾雜，“氣滯、氣虛、濕熱、血瘀”等貫穿病程發展的始終，在不同階段又有所側重[1]。治療上多采用清熱化痰、益氣養陰、活血通絡等法[2]。黃連、半夏是中醫臨床常用藥對之一，也是慢性萎縮性胃炎中醫及中西醫結合診療共識意見中所推薦方劑連樸飲、黃連溫膽湯、半夏瀉心湯的“君藥”組成部分[3]，對治療慢性萎縮性胃炎具有堅實的臨床基礎[1]。相關研究發現，在慢性萎縮性胃炎發病過程中Janus激酶2(Janus kinase，JAK2)/信號轉導與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)信號通路的激活可以導致胃黏膜細胞的異常增殖、血管新生以及向惡性轉化，并最終導致惡性腫瘤的發生與發展[4]；胃癌患者胃黏膜中Yes相關蛋白1(yes-associated protein 1，YAP1)陽性率顯著高于正常人胃黏膜、慢性萎縮性胃炎及腸上皮化生患者，其在胃黏膜中的過表達與胃癌的進展、淋巴結轉移及不良預后密切相關[5]；血管新生是影響慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變相關預后轉歸的重要因素[6]?；诖?，本次研究首先采用分子對接的方法探討黃連半夏藥對中有效活性成分與慢性萎縮性胃炎發病過程中關鍵性靶標白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、YAP1、STAT3、JAK2、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factorreceptor，EGFR)的結合性；然后，通過動物實驗方法建立慢性萎縮性胃炎大鼠模型，采用黃連與半夏的水煎液進行干預治療；最后，通過檢測血液和胃黏膜組織中相關靶標的表達情況，以探究該藥對防治慢性萎縮性胃炎的作用機制，為后繼研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 軟件與數據庫

Auto Dock Tools 1.5.7軟件、Vina軟件、Discovery Studio 2016軟件、TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)。

1.1.2 動物

5周齡SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體重180±15 g，購于湖北省疾病預防控制中心動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2020-0018。飼養于風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室IVC實驗動物籠具中常規飼養，溫度23±2 ℃，相對濕度70%～75%，晝夜各半間斷照明。本實驗經湖北民族大學醫學倫理委員會審查批準(2021019號)。

1.1.3 藥材與主要試劑

中藥材黃連飲片(產地四川，批號：2005052，以下簡稱CR)；半夏飲片(產地湖北，批號：20200521，以下簡稱PR)購于宜昌人福藥業，均經湖北民族大學藥用植物學專業李厚聰副教授鑒定為毛莨科黃連屬植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、天南星科半夏屬植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。用藥比例設置為1∶1，以臨床常規用量各15 g計算，各稱取15 g加水300 mL浸泡60 min后煎煮30 min留取藥液，濃縮至生藥比1 g/mL，4 ℃冰箱保存備用。

N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍(MNNG)溶液(東京化成工業株式會社生產，批號：WMUSI-LJ)；雷尼替丁(宜昌人福藥業，批號：88B09041)；維酶素片(樂普恒久遠藥業，批號：20190705)； IL-6 ELISA試劑盒(伊萊瑞特，批號：E-EL-R0015C)；IL-1βELISA試劑盒(欣博盛，批號：ERC007)；Trizol試劑盒(Aidlab，批號：252250AX)；蘇木素(Sigma，批號：H9627)；伊紅(國藥集團，批號：71014544)；磷酸酶抑制劑(碧云天，批號：S1873)；PMSF(阿拉丁，批號：P105539)；RIPA裂解液(碧云天，批號：P0013B)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號：P0010)；TEMED(國藥集團，批號：80125336)；兔多抗p-YAP1(Affinity，批號：Af3328)；兔單抗p-STAT3(Cell signaling，批號：9145)；X光膠片(銳珂，批號：6535876)等。

1.1.4 主要儀器

酶標儀(Thermo scientific Multiskan，MK3型)；PCR儀(ABI，Quant Studio 6型)；紫外分析儀(北京君意東方，JY02S型)；電轉儀(北京六一儀器廠，DYCZ-40型)；凝膠成像系統(美國Aplegen公司，Omega Fluor型)等。

1.2 方法

1.2.1 分子對接

在TCMSP數據庫中檢索中藥黃連、半夏的成分數據，以同時滿足分子量(molecular weight，MW)<500、脂水分配系數(Alog P)<5、氫鍵供體(Hdon)<5、氫鍵受體(Hacc)<10、藥物半衰期(drug half-life，HL)≥4、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥20%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.1篩選主要活性成分，并下載Mol2格式文件，經AutoDock Tools 1.5.7軟件進行能量最小化等處理，并定義為配體。在RCSB PDB數據庫中檢索受體IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR所對應的PDB晶體結構文件，經Auto Dock Tools 1.5.7去水加氫等預處理后，定義活性位點，轉化為PDBQT格式文件。利用Auto Dock vina軟件將配體與受體進行分子對接，選取最佳(結合能得分數值越小代表結合性越好)對接構象，用Discovery Studio 2016軟件分析對接構象的結合情況。為了驗證本次分子對接結果的可靠性，本研究將各受體自帶配體抽取出來后再次對接到原受體中，并計算對接模式的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)值，以RMSD≤2評估對接結果的可靠性。

1.2.2 動物分組造模與藥物干預

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為6組，正常對照組(A組)、模型組(B組)、維酶素組(C組)、低劑量組(D組)、中劑量組(E組)、高劑量組(F組)，每組10只。參照文獻[1]建模方法復制大鼠模型，A組予以常規飼養；B～F組每日自由飲用量濃度為120 mg/L的MNNG溶液，飲水瓶用黑色塑料袋包裹后使用，此外每周(周1、周4)進行2次1 mL/100 g的MNNG溶液灌胃加強；進食2 d后禁食1 d，進食期間給予0.03 g/kg尼替丁的飼料喂養，進食第1 d予以56 ℃ 15% NaCl溶液灌胃(1 mL/100 g)；禁食當天予以40%乙醇灌胃(1 mL/100 g)。造模14周時，隨機挑選1只，用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后，摘取胃組織進行常規HE染色觀察，鏡下證實胃黏膜固有腺體萎縮，表明造模成功。此后，B～F組進行灌胃治療，B組采用生理鹽水灌胃(1 mL/100 g)，按照人與大鼠體表面積折算公式換算為大鼠用量，D組給予中藥1.562 5 g/kg灌胃、E組給予中藥3.125 g/kg灌胃、F組給予中藥6.25 g/kg灌胃，C組給予維酶素0.3 g/kg灌胃，每日1次，連續干預8周。末次給藥結束12 h后，用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，腹主動脈取血進行血清學指標檢測，摘取一部分胃組織超低溫(-80 ℃)保存備用，另一部分進行形態學檢測。

1.2.3 大鼠胃黏膜組織形態檢測

利用10%多聚甲醛溶液固定大鼠胃組織48 h后，取胃中段組織進行梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(4 μm)，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4 ELISA檢測

大鼠血液樣本靜置30 min后，以3 000 r/min離心10 min后采集血清，按照試劑盒說明書要求進行檢測，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測

按照試劑盒說明書要求操作，采用Trizol法提取胃中段組織RNA，并逆轉錄成cDNA，設計引物序列(見表1)，實時熒光定量PCR檢測胃組織中JAK2、STAT3、AKT1、YAP1、VEGF、EGFR mRNA的表達。以GAPDH表達量作為內參，采用2-△△Ct法對數據進行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 Western blot檢測

參照試劑盒說明書操作要求，提取大鼠胃中段組織中總蛋白，采用酶標儀測定蛋白濃度OD值，并計算出樣品蛋白濃度。依次進行蛋白變性、電泳、電泳分離、電轉移(轉膜條件：GAPDH，200 mA 90 min、p-STAT3，200 mA 120 min后300 mA 15 min；p-JAK2 200 mA，120 min后300 mA，30 min；p-AKT1、p-YAP1 200 mA 120 min)、ECL顯色：封閉，滴加封閉液稀釋的一抗(抗體稀釋濃度GAPDH，1∶1 000；p-STAT3，1∶1 000；p-JAK2，1∶1 000；p-AKT1，1∶2 000；p-YAP1，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，用TBST稀釋相應的HRP標記二抗(1∶50 000稀釋)，室溫搖床孵育2 h，顯影、定影，沖洗膠片、掃描，用Band Scan分析膠片灰度值，以GAPDH為內參，目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 分子對接結果

經篩選獲得符合篩選條件的有效活性成分共計13個，其中黃連8個、半夏5個，見表2所示。將這些主要活性成分與IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR進行分子對接，對接結果表明13種主要活性成分均能與靶標結合，選取最佳對接構象作圖(見圖1)，結合能得分見熱圖所示(見圖2)。在對接驗證過程中，將各受體的原配體抽取出來后重新對接到原受體中，計算出的RMSD值均<2，說明對接參數可靠，對接結果可信。分子對接結果提示：黃連半夏主要活性物質能夠作用于慢性萎縮性胃炎發生機制中的IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR靶標，進而發揮干預作用，其中主要活性成分與JAK2的結合能得分性最為突出，推測JAK2可能是其發揮防治作用的核心靶標之一，黃連堿(coptisine)可能是最佳成分之一。

表2 黃連、半夏中潛在活性化合物信息Table 2 Information of potential active compounds in CR and PR

2.2 對大鼠胃黏膜組織病理變化的影響

HE染色后鏡下觀察發現(見圖3)：A組大鼠胃黏膜組織上皮完整，腺體、細胞排列整齊，無炎癥浸潤；B大鼠胃黏膜組織上皮萎縮，腺體數目減少、排列紊亂，大量炎癥浸潤，部分腸上皮化生；C組較B組好轉，但腺體排列仍紊亂、萎縮，炎癥浸潤，少量腸上皮化生；D、E、F組較B、C組明顯好轉，但腺體數量較少，未見明顯腸化生。HE染色結果提示：黃連半夏水煎液能夠對化學物質損傷與饑飽失常狀態下的慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜組織起到抑制炎癥和修復作用。

圖1 分子對接結果(2D)Fig.1 Molecular docking results(2D)注：a：黃連堿與YAP1；b：黃連堿與JAK2；c：甲基黃連堿與STAT3；d：甲基黃連堿與VEGF；e：甲基黃連堿與EGFR；f：(R)-Canadine與IL1β；g：小檗浸堿與IL-6。Note:a:Coptisine and YAP1; b:Coptisine and JAK2; c:Worenine and STAT3; d:Worenine and VEGF; e:Worenine and EGFR; f:(R)-Canadine and IL1β (2D); g:Berlambine and IL-6.

圖2 分子對接得分熱圖Fig.2 Heat map of molecular docking scoring

2.3 對大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β濃度的影響

血清酶聯免疫檢測發現：B組大鼠血清IL-6、IL-1β濃度較A組顯著升高(P<0.01)，差異具有統計學意義；C、D、E、F組較B組顯著降低(P<0.01)差異?統計學意義。見圖4所示。結果提示：造模后大鼠血清炎癥水平(IL-1β、IL-6)呈明顯上升趨勢，黃連、半夏藥對水煎液能夠顯著降低血清炎癥因子水平，發揮抑制炎癥的治療作用，特別以中劑量作用顯著，并較維酶素更具有優勢。

2.4 對大鼠胃黏膜組織中各指標 mRNA表達的影響

經過對大鼠胃組織進行RT-PCR檢測發現(見圖5)：在YAP1、JAK2、STAT3、AKT1、VEGF、EGFR mRNA表達量上，B組顯著高于A組(P<0.01)差異具有統計學意義。經過治療干預后，C組在AKT1 mRNA水平上與B組沒有統計學意義(P>0.05)，在YAP1、JAK2、STAT3、VEGF、EGFR mRNA水平上均顯著低于B組(P<0.01)差異具有統計學意義。D、E、F組在各指標水平上均顯著低于B、C組(P<0.01)差異具有統計學意義。

圖3 各組大鼠胃組織HE染色(×200)Fig.3 HE staining of gastric tissues of rats in each group (×200)注：A：正常對照組；B：模型組；C：維酶素組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組，下同。Note:A:Normal control group; B:Model group；C:Vitase group; D:Low-dose group; E:Medium-dose group; F:High-dose group,the same below.

圖4 血清IL-6、IL-1β濃度Fig.4 Serum concentrations of IL-6 and IL-1β 注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01。Note:Compared with group A, **P < 0.01; Compared with group B,##P < 0.01.

RT-PCR實驗結果提示：模型大鼠胃黏膜組織中YAP1、JAK2、STAT3、AKT1、VEGF、EGFR mRNA水平顯著升高，呈現過表達狀態，經過黃連、半夏水煎液灌胃干預后，顯著下調了相關靶標的表達水平，對慢性萎縮性胃炎具有治療作用，其作用機制與調控JAK2/STAT3炎癥信號通路和血管新生途徑(VEGF、EGFR)有關。

圖5 各組胃組織中YAP1、STAT3、JAK2、AKT1、VEGF、EGFR mRNA的表達Fig.5 mRNA expressions of YAP1,STAT3,JAK2,AKT1,VEGF and EGFR in gastric tissues of each s,n = 10)注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with group A,**P < 0.01; Compared with group B,#P<0.05，##P<0.01.

2.5 對大鼠胃黏膜組織各關鍵指標磷酸化水平的影響

經過WB實驗檢測發現(見圖6所示)：在p-YAP水平上，B組顯著低于A組(P<0.01)差異具有統計學意義，C、D、E、F組均較B組顯著升高(P<0.01)差異具有統計學意義。表明造模后的胃黏膜組織中p-YAP水平較正常狀態下的表達水平有所降低，經過藥物干預后的p-YAP水平顯著上調，黃連、半夏水煎液的上調作用顯著優于維酶素。

在p-STAT3、p-AKT1、p-JAK2水平上，B組顯著高于A組(P<0.01)差異具有統計學意義，C、D、E、F組較B組顯著降低(P<0.01)差異具有統計學意義。表明模型大鼠胃黏膜組織中p-STAT3、p-AKT1、p-JAK2水平顯著高于正常大鼠，持續的炎癥刺激促進了JAK2/STAT3炎癥信號通路的激活，經過黃連、半夏水煎液干預后的磷酸化水平明顯下調，抑制了JAK2/STAT3信號通路的激活。

圖6 各組大鼠胃黏膜組織中p-STAT3、p-YAP、p-AKT1、p-JAK2表達水平Fig.6 Expression levels of p-STAT3,p-YAP,p-AKT1 and p-JAK2 in gastric mucosa of rats in each s,n = 10)注：與A組比較，**P<0.01；與B組比較，##P<0.01。Note:Compared with group A,**P < 0.01; Compared with group B,#P<0.05，##P<0.01.

3 討論與結論

黃連、半夏作為半夏瀉心湯、連樸飲、黃連溫膽湯的共同使用中藥，在各方劑中發揮“君臣”作用。黃連屬毛茛科黃連屬多年生草本植物，主要含生物堿類、黃酮類、木脂素類、酸性成分等，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效[7]；半夏屬天南星目天南星科半夏屬植物，含有生物堿、有機酸、甾醇類、氨基酸、揮發油、無機元素等多種化學成分，具有燥濕化痰、降逆止嘔的作用[8]。黃連半夏相配，一溫一寒無藥性過偏之慮，一辛一苦辛開苦降調暢氣機，一清一消清消結合，共同發揮和胃止嘔、清熱化痰、消痞散結、解毒消腫的效用，切合慢性萎縮性胃炎的病因病機規律。本次研究通過嚴格的Lipinski規則篩選到黃連與半夏中所含的13種主要活性成分，其中黃連8種、半夏5種。通過分子對接發現，以小檗堿、甲基黃連堿等為代表的主要活性成分均能與慢性萎縮性胃炎的核心靶標IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、VEGF、EGFR結合，一定程度上代表了黃連、半夏防治慢性萎縮性胃炎的主要藥效物質基礎。

現代研究發現，炎癥作為慢性萎縮性胃炎早期的主要病理改變，在“非可控性炎癥”作用下促使病變的胃黏膜組織向惡性轉化，加速癌癥的早期血管生成。臨床與實驗研究證實慢性萎縮性胃炎胃黏膜中JAK2/STAT3等炎癥信號通路的激活[9]，促炎細胞因子(IL-6、IL-1β等)表達上調[10]，血管新生途徑(VEGF、EGFR等)的活化在這一演變過程中發揮著重要的作用。YAP1作為Hippo信號通路中關鍵的轉錄共激活因子，調控著細胞的生長、增殖和凋亡[11]。在正常情況下YAP1以磷酸化的形式存在于細胞漿中，參與器官及組織的再生調節。在非可控性炎癥等上游異常信號作用下，YAP1去磷酸化后進入細胞核，促進相關癌癥基因的表達與細胞增殖，并決定著致癌活性的大小[12,13]。AKT1參與胃癌的發生發展及浸潤轉移[14]，干擾AKT1表達能抑制胃癌細胞增殖與遷移[15,16]。因此，IL-1β、IL-6、YAP1、STAT3、JAK2、AKT1、VEGF、EGFR在慢性萎縮性胃炎的發病機制中發揮著重要的作用，是防治其向惡行發展的重要靶標。

本次實驗在MNNG溶液、熱鹽、乙醇等化學物質及饑飽失常等復雜條件的長期刺激下，添加含雷尼替丁(臨床常用的選擇性H2受體拮抗劑)飼料以抑制模型動物的胃酸分泌，促使飲用入胃的硝酸鹽快速轉為亞硝酸鹽，加速造模。經HE病理檢測發現該方法成功建立了慢性萎縮性胃炎模型。維酶素是目前用于治療慢性萎縮性胃炎的常見西藥，主要成分為核黃素、黃素單核苷酸以及多種維生素及氨基酸，具有促進胃黏膜上皮與腺上皮再生的作用，與多成分的中藥具有較強的對比意義。經過對各指標進行檢測發現，在大鼠血液中的炎性細胞因子IL-6、IL-1β顯著升高，形成炎癥微環境；引起p-JAK2、p-STAT3水平的升高，激活JAK2/STAT3信號通路，促使炎癥向非可控性發展，進而導致VEGF、EGFR活化，加速癌癥的早期新生血管形成，并引發YAP1去磷酸化(p-YAP1)，導致AKT1的過表達，進而損傷胃黏膜組織形態，誘導慢性萎縮性胃炎向惡性腫瘤演變。經過黃連半夏藥對中多種活性成分共同干預治療后，顯著抑制了血清炎性細胞因子IL-6、IL-1β的表達，同時降低了胃黏膜組織中JAK2/STAT3信號通路關鍵指標的磷酸化水平，抑制通路激活，改善炎癥微環境，降低組織中VEGF、EGFR的表達，進而影響腫瘤血管新生，并調控YAP1、AKT1的過表達，修復受損的組織形態，延緩或阻斷慢性萎縮性胃炎向惡性轉變，進而對慢性萎縮性胃炎發揮治療作用，在這一過程中以黃連半夏配伍的中劑量具有顯著優勢，且優于維酶素，沒有發現劑量依賴。因此，我們認為黃連、半夏是防治慢性萎縮性胃炎的核心藥物，其作用機制與調控炎癥信號通路、抑制腫瘤血管新生等途徑密切相關。