生地黃水提物對大鼠睡眠的影響及其機制研究

李堯善，申 旻，王 盼*

1西北大學化工學院；2西北大學生物醫藥研究院，西安 710069； 3陜西省太白酒業有限責任公司，寶雞 722300

失眠在中醫領域有多種名稱，比如“不寐”“目不瞑”等，一般認為是機體受到外界及自身內部多種因素刺激進而導致的無法入睡、晨起困倦等心神不寧的現象。失眠同時還伴有其他癥狀，比如難以啟動和維持睡眠、晨起早醒、難以重新入睡等[1]。目前全球失眠癥的患病率估計在10%～40%之間，不同程度的失眠都會對機體造成影響，比如短時間的失眠可使人面容憔悴、精神疲憊，而長時間的失眠極易導致焦慮、抑郁等消極情緒，甚至可能引起心理障礙和精神疾病。因此改善睡眠質量，保障正常的生理作息規律，是亟待解決的社會和健康問題。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料：生地黃(批號C0402106072，陜西嘉禾生物科技股份有限公司)；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉(批號P11011、B0500，美國Sigma公司)；5-HT、GABA、NA、DA和Glu檢測試劑盒(批號20210504、20210509、20210609、20210802、20210504，南京建成生物工程研究所)；梓醇、地黃苷D(批號SB21678、S38002，北京譜析標準技術有限公司)；TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA酶聯免疫吸附試劑盒(批號RA20035，RA20020，RA20607，武漢伊萊特生物科技有限公司)；RNAeasyTM動物RNA提取試劑盒、BeyoRTTMII cDNA反轉錄試劑盒、BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR試劑盒(批號R0024、D7168L-1、D7268M-1，碧云天生物技術有限公司)。

實驗儀器：ME104E/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Z36-HK型離心機(美國賽默飛)；ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

實驗動物：SPF級SD雄性大鼠，購自中國人民解放軍第四軍醫大學動物實驗中心，體重180～210 g(許可證號SCXK(陜)2019-001)；SPF級KM小鼠，購自陜西省西安市西安交通大學醫學部實驗動物中心，體重18～22 g(許可證號SCXK(陜)2018-001)。飼養條件為屏障級動物房(溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%)，12 h照明和12 h黑暗交替模擬正常生長環境，自由攝食和飲水。動物實驗嚴格按照中華人民共和國《實驗動物管理條例》進行，嚴格按照實驗動物倫理要求操作，實驗開展經過西北大學動物倫理委員會批準(NWU-AWC-20210809M)。

1.2 方法

1.2.1 生地黃水提物的制備及分析

取生地黃200 g，搗碎后加10倍水浸泡1 h，再煎煮30 min，過濾后重復3次并合并濾液。經60 ℃減壓濃縮后經噴霧干燥(進風溫度140～190 ℃，出風溫度75～85 ℃)，干燥后粉碎過80目篩密封保存，生地黃水提物的得率為20%。生地黃水提物成分分析參照《中國藥典》(2020版)中地黃的含量測定及通則0512進行[4]，梓醇檢測以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(體積比1∶9)為流動相，檢測波長為210 nm；地黃苷D檢測以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%磷酸溶液(體積比1∶19)為流動相，檢測波長為203 nm。

1.2.2 生地黃水提物改善大鼠睡眠的評價方法

為評估生地黃水提物改善睡眠的效果，選擇SD雄性大鼠，參照《保健食品功能檢驗與評價方法》(2022版)中“有助于改善睡眠”的檢驗方法設置三組。每組均設4個亞組，每個亞組10只動物，分別為對照組、生地黃水提物低劑量組(RR-L，150 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量3.75 g/d)、生地黃水提物中劑量組(RR-M，300 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量7.5 g/d)、生地黃水提物高劑量組(RR-H，600 mg/kg·BW，生藥量折合人體劑量15 g/d)，每天給各劑量組動物灌胃給藥一次，對照組給予等體積的ddH2O灌胃，連續進行30 d并每天記錄大鼠的體重。直接睡眠實驗通過判斷末次給藥后大鼠進入睡眠狀態的數量，依據為當大鼠置于背臥位時，超過30～60 s不能翻正，即說明大鼠翻正反射消失，進入睡眠。延長戊巴比妥鈉睡眠時間的試驗通過預實驗確定戊巴比妥鈉溶液劑量為50 mg/kg·BW，在末次給藥15 min后，按0.1 mL/10 g·BW腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg·BW，開始觀察大鼠是否有翻正反射，當翻正反射消失達1 min為睡眠指標，觀察并記錄生地黃水提物能否延長戊巴比妥鈉睡眠時間。戊巴比妥鈉閾下劑量的催眠試驗通過預實驗確定戊巴比妥鈉的閾下催眠劑量為30 mg/kg·BW。生地黃水提物于末次灌胃15 min后，給大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉閾下催眠劑量(30 mg/kg·BW)，以翻正反射消失達1 min以上為入睡判斷標準，記錄30 min內入睡動物數。觀察并記錄規定時間內入睡的大鼠動物只數。巴比妥鈉的睡眠潛伏期試驗是在末次給藥15 min后，大鼠腹腔注射0.1 mL/10g·BW的巴比妥鈉(250 mg/kg·BW)，觀察并記錄大鼠的睡眠潛伏期時間。

1.2.3 氯苯丙氨酸(PCPA)誘導失眠大鼠模型的建立

將50只SD大鼠分為兩組，模型組(n= 40)腹腔注射PCPA溶液(400 mg/(kg·d))，每天上午九點開始注射一次，連續注射三天。對照組(n= 10)腹腔注射等體積0.9%的生理鹽水。最后一次注射24 h后，對大鼠活動進行監測。失眠模型大鼠行為特征包括晝夜節律喪失、興奮性和攻擊性增強、尿液和糞便增多等現象。此外通過大鼠眼眶取血后測定血清中5-HT含量，定量判斷失眠大鼠模型是否成功建立。

1.2.4 生地黃水提物對PCPA失眠大鼠的治療給藥

將40只建模成功的大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為模型組，RR-L組(生地黃水提物150 mg/kg·BW)、RR-M組(生地黃水提物300 mg/kg·BW)、RR-H組(生地黃水提物600 mg/kg·BW)。每天給各劑量組動物灌胃給藥一次，連續給藥7 d，對照組和模型組給予等體積的0.9%生理鹽水。每天給藥后放回籠內并保證籠內鼠糧和水。

1.2.5 大鼠下丘腦組織內中樞神經遞質含量的測定

最后一次給藥后開始斷食供水，12 h后10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死，快速剝離腦組織并確定下丘腦位置后取約1 mm深度的下丘腦組織，用已經預冷卻的生理鹽水清洗組織3次，再用干凈的濾紙拭干，加入9倍質量的生理鹽水，玻璃勻漿器勻漿(冰水浴條件下)，采用低溫4 ℃方式(5 000 r/min)離心10 min，取上清用于檢測。嚴格按照GABA、5-HT、Glu、DA、NA各試劑盒步驟對其含量進行檢測。

1.2.6 大鼠下丘腦中神經遞質相關受體mRNA表達量的測定

低溫條件下將收集的大鼠下丘腦組織進行總RNA的提取。利用反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，測定神經遞質GABA的受體GABAAα1和GABAAα2、5-HT的受體5-HT1α和5-HT2α、Glu的受體mGluR1和mGluR2、DA受體D2的mRNA表達情況，內參基因為β-actin。通過2-ΔΔCt法計算相關受體基因的相對表達量。擴增引物的序列見表1。

表1 大鼠下丘腦中神經遞質相關受體的引物序列Table 1 Primer sequences for neurotransmitter-associated receptors in the rat hypothalamus

1.2.7 大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量的測定

最后一次給藥后開始斷食供水，12 h后麻醉采血并迅速離心(5 000 r/min，5 min)，收集血清，根據大鼠TNF-α、IL-1β和IL-10檢測試劑盒檢測相關炎癥因子的含量。

1.2.8 生地黃水提物的小鼠急性毒性試驗

急性毒性試驗主要參照GB15193.3-2014的試驗方法進行[5]。其中，小鼠急性經口毒性試驗灌胃劑量分別為15 000、30 000 mg/kg·BW(以樣品干重計，下同)，給藥體積為20 mL/kg體重。

選購KM小鼠60只(雄性30只，雌性30只)，體重18～22 g。觀察5 d后，隨機按體重分成3組，每組各20只，其中雄性(M)10只，雌性(F)10只。3組分別為：急性毒性低劑量組(AT-L-M組和AT-L-F組，15 000 mg/kg·BW，折合人體生藥劑量為75 g/d)，急性毒性高劑量組(AT-H-M組和AT-H-F組，30 000 mg/kg·BW，折合人體生藥劑量為150 g/d)，對照組(對照組-M，對照組-F，給予等體積的ddH2O)，試驗周期14 d。每天觀察試驗小鼠的表現，在試驗周期的0、3、7、14 d，稱量小鼠體重，評價生地黃水提物對小鼠體重的影響。在小鼠灌胃給藥后需連續觀察4 h，注意小鼠的飲食情況等有無異常，之后每天最少進行1次觀察，連續觀察14 d。試驗結束后觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎等器官的組織、顏色和質地有無異常變化。

1.2.9 統計方法

用SPSS 21.0軟件進行數據的轉化和統計學分析。先對數據進行方差齊性檢驗，若方差齊性，采用單因素方差分析進行總體比較，發現差異再用Dunnett法進行多個劑量組與一個對照組均數間的兩兩比較。若方差出現不齊現象，則對原始數據進行適當的變量轉換，滿足方差齊性檢驗后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到方差齊性的目的，改用秩和檢驗進行統計，發現總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane’s T2檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 生地黃水提物成分分析

生地黃水提物經過干燥處理后得率為20%。將生地黃水提物配置成0.5 g/mL溶液，通過HPLC-DAD檢測各成分濃度，其中梓醇和地黃苷D的含量分別為15、12 mg/mL。

2.2 生地黃水提物改善大鼠睡眠的試驗評價

經口灌胃后連續記錄大鼠的體重，由表2可見，與對照組相比，RR-L、RR-M和RR-H三個給藥組對大鼠體重無顯著影響，各組大鼠體重增長趨勢一致，皮毛有光澤，飲食、活動正常，表明不同劑量的生地黃水提物對大鼠正常生長無影響(P>0.05)。

表2 生地黃水提物對大鼠體重的影響Table 2 Effects of Rehmanniae Radix water extract on body weight in rats

大鼠直接睡眠作用研究試驗表明，經口灌胃后，對照組與RR-L、RR-M和RR-H三個給藥組的大鼠在30 min內均沒有出現進入睡眠的現象，說明生地黃水提物的各劑量組均對大鼠無直接睡眠作用。

根據圖1A可知，經口灌胃給予各劑量組對應藥物30 d后，與對照組相比，RR-L、RR-M和RR-H三個給藥組均對戊巴比妥鈉誘導的大鼠睡眠時間具有延長作用，延長率分別為24.30%、25.19%和20.29%，且與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗結果由表3可知，各劑量組灌胃給予對應藥物30 d后，RR-H組睡眠發生率與對照組相比差異顯著(P<0.05)，說明生地黃水提物高劑量組(600 mg/kg·BW)與閾下劑量的戊巴比妥鈉在助眠方面有協同增效的作用。

表3 生地黃水提物對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的大鼠睡眠發生率的作用Table 3 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the incidence of sleep in rats induced by subthreshold sodium pentobarbital

巴比妥鈉的睡眠潛伏期試驗結果由圖1B可見，經口灌胃給予各劑量組對應藥物30 d后，與對照組相比，RR-M和RR-H能顯著縮短大鼠睡眠潛伏期(P<0.05)，縮短率分別為41.79%和43.18%。RR-L組大鼠的睡眠潛伏期雖然也比對照組有所縮短，但差異無統計學意義。

圖1 生地黃水提物對大鼠睡眠時間及睡眠潛伏期的影響Fig.1 Effects of Rehmanniae Radix water extract on sleep time and sleep latency in rats注：與對照組比較，*P<0.05。Note:Compared with control group,*P<0.05。

根據《保健食品功能檢驗與評價方法》(2022版)中“有助于改善睡眠”的結果判定，本研究中生地黃水提物各劑量均對大鼠體重無直接影響，對大鼠無直接睡眠作用，且能夠延長戊巴比妥鈉睡眠時間，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導大鼠的睡眠發生率，并且生地黃水提物中、高劑量組能顯著縮短大鼠睡眠潛伏期。綜上結果，可判定生地黃水提物具有有助于改善睡眠的作用。

2.3 失眠大鼠模型的建立

利用PCPA誘導動物是國際公認的一種研究失眠機制模型的方法。如圖2所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中5-HT含量顯著降低，且模型組大鼠集中表現出晝夜節律消失、興奮性和攻擊性增強、尿液和糞便偏多等現象，說明本研究中失眠大鼠的模型已構建成功。

2.4 生地黃水提物對失眠大鼠下丘腦內神經遞質的影響

由表4可見，與對照組相比，模型組大鼠下丘腦中GABA和5-HT含量顯著降低(P<0.01)，而GLu、NA和DA均含量顯著升高(P<0.05)，該結果符合失眠小鼠相關神經遞質含量的變化趨勢。

圖2 大鼠血清中5-HT的含量Fig.2 The content of 5-HT in rat serum注：與對照組比較，**P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01.

與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著提高大鼠下丘腦中GABA和5-HT的含量，且生地黃水提物高劑量組對大鼠GABA和5-HT的效果更顯著一些(P<0.01)。Glu和DA含量在各給藥組的含量顯著降低(P<0.05)，而NA含量在各給藥組雖有降低，但是結果不具有統計學意義(P>0.05)。

表4 生地黃水提物對大鼠下丘腦內神經遞質含量的影響Table 4 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the content of neurotransmitters in hypothalamus of

2.5 生地黃水提物對大鼠下丘腦中神經遞質相關受體mRNA表達的影響

由圖3可見，與對照組相比，模型組大鼠的GABA受體GABAAα1和GABAAα2mRNA表達量、5-HT的受體5-HT1α和5-HT2αmRNA表達量均顯著降低(P<0.05)，而Glu的受體mGluR1和mGluR1 mRNA表達量、DA的受體D2mRNA表達量顯著提高(P<0.05)。與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著提高GABA受體GABAAα1和GABAAα2、5-HT受體5-HT1α和5-HT2α的mRNA表達量(P<0.05)，顯著降低Glu的受體mGluR1和mGluR2、DA受體D2mRNA的表達量(P<0.05)。

2.6 生地黃水提物對失眠大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量的影響

由表5可見，與對照組相比，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α(P<0.01)和IL-1β(P<0.05)含量顯著增加，IL-10含量顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，生地黃水提物各組均能顯著降低TNF-α的含量(P<0.05)，而RR-M組和RR-H組均可以顯著減低IL-1β(P<0.05)和提高IL-10的含量(P<0.05)。

圖3 大鼠下丘腦中各神經遞質受體的mRNA表達情況Fig.3 mRNA expression of neurotransmitter receptors in rat hypothalamus注：與對照組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01；Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

表5 生地黃水提物對大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-10含量的影響Table 5 Effects of Rehmanniae Radix water extract on the contents of TNF- α,IL-1β and IL-10 in rat

2.7 生地黃水提物對小鼠的急性毒性試驗

為了評估生地黃水提物的安全性，對生地黃水提物進行急性毒性試驗。試驗期間雄(M)、雌性(F)小鼠體重情況如圖4所示。與對照組的健康小鼠相比，急性毒性低劑量組(AT-L-M組和AT-L-F組)和高劑量組(AT-H-M組和AT-H-F)小鼠在同一時間段體重差異不顯著(P>0.05)，并且試驗組中各小鼠均未出現驚厥不安、腹瀉或者便秘、豎毛等急性不良反應，無動物死亡，各劑量組小鼠心、肝、脾、腎等臟器均未見肉眼可見的異常情況。

3 討論與結論

目前改善睡眠的實驗研究大多從動物行為學和神經遞質等方面開展工作。本實驗通過動物行為的藥理學研究，探討了生地黃對大鼠直接睡眠、戊巴比妥鈉及閾下劑量所致大鼠睡眠發生率和時間、巴比妥鈉所致大鼠睡眠潛伏期的影響。由于藥物對中樞系統的興奮或抑制可通過大鼠的行為進行反應，通過大鼠的自主活動證明了生地黃能夠顯著減少大鼠活動，具有明確的改善睡眠效果。此外，生地黃水提物高劑量組的大鼠對戊巴比妥鈉閾下劑量所致的大鼠睡眠發生率顯著提高也說明生地黃在改善睡眠方面與肝酶的代謝無關。小鼠急性毒性試驗研究表明當生地黃水提物為30 000 mg/kg·BW(折合人體生藥劑量為150 g/d)時，小鼠各特征指標均無明顯變化，根據文獻報道的藥物毒性分級標準，當LD50>15 000 mg/kg劑量時，即認為該物質屬于無毒級[6]，本試驗中最大劑量組已超過15 000 mg/kg，所以可認定生地黃水提物屬于無毒級別，具有良好的安全性，機體能夠長期服用。

圖4 小鼠的體重變化圖Fig.4 The change of body weight in mice

5-HT、NA和DA是一類單胺類神經遞質，其中5-HT可以調節中樞神經穩態并參與睡眠過程的發生[12]，國際上廣泛應用的PCPA誘導動物失眠模型就是根據PCPA抑制5-HT合成的方法使動物出現相應失眠癥狀。NA通過促進神經元興奮達到維持覺醒的目的[15]，DA在睡眠的覺醒中發揮重要作用[16]。本研究中這三種神經遞質在生地黃水提物作用于大鼠時下丘腦中相關含量變化如表4所示，與模型組相比，其中給藥組NA含量略有降低，但是不具有統計學意義，可能受多種因素的共同作用，結果有待于進一步分析。5-HT和DA的含量均有變化，特別是生地黃水提物中、高劑量組有顯著性變化。由于5-HT發揮作用必須與相應受體相結合，在已知的受體中，與抗失眠研究相關性最高的是5-HT1α和5-HT2α受體，主要參與睡眠的覺醒活動，其含量多少與他們覺醒周期的長短密切相關[17]。本研究發現給藥組的下丘腦中5-HT1α和5-HT2α受體mRNA表達量顯著增加，結合5-HT含量變化，提示生地黃水提物改善睡眠的途徑和5-HT的含量增加，使其受體介導的生理作用發生變化相關。由于多巴胺受體D2是維持覺醒的重要的受體[18]，通過檢測給藥之后大鼠多巴胺受體D2的mRNA表達水平顯著下降，說明生地黃水提物能夠從調節多巴胺及其受體方面改善大鼠睡眠。

炎癥因子的調控也能夠影響睡眠-覺醒過程的發生。正常睡眠時細胞炎癥因子的分泌具有規律性，而睡眠障礙會導致免疫反應的異常。例如長期慢性睡眠限制導致腦內促炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β含量的升高，但是過度的升高也會損害睡眠，抗炎性細胞因子IL-10含量顯著降低[19]，而夜間睡眠總時間減少也可導致系統性炎癥狀態的改變[20]。Porkka等[21]也揭示了睡眠節律和免疫活動之間的關系，睡眠不足會導致與免疫相關的基因表達發生變化，并增加促炎因子的產生和釋放。因此炎癥因子的紊亂也是失眠的重要影響因素。本研究中生地黃水提物在改善大鼠睡眠的同時，細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10均發生了變化，推測生地黃水提物改善睡眠的與細胞炎癥因子的調節也密切相關。Sun等[22]研究雙夏湯的催眠鎮靜作用時也發現炎癥因子TNF-α和IL-1在失眠大鼠中含量顯著降低，此外5-HT及其代謝物HIAA、受體5-HT1A和5-HT2A在失眠大鼠中含量增加，說明5-HT系統和免疫系統參與其中，并且認為PCPA誘導的失眠大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸興奮，這可能是由于5-HT阻滯劑降低了5-HT水平，導致TNF-α大量升高，從而促進5-HT的再合成。結合本實驗中樞神經遞質含量及受體的變化，說明生地黃水提物可通過調節神經遞質和細胞炎癥因子共同改善大鼠睡眠。

綜上所述，本研究在初步判斷生地黃水提物能夠改善大鼠睡眠和安全性的基礎上，進一步采用PCPA失眠大鼠模型探討了生地黃水提物改善睡眠的作用機制。結果表明生地黃水提物能顯著改善失眠大鼠下丘腦中GABA、5-HT、Glu和DA神經遞質的水平和相應受體mRNA的表達，此外細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10含量也相應發生變化，說明生地黃水提物可通過調節神經遞質和細胞炎癥因子改善大鼠睡眠。關于生地黃水提物中主要成分的生理功能，以及如何進一步改善睡眠的途徑和作用機制需要未來開展更加深入的研究。