西沙群島海濱大戟化學成分研究

趙 煥，吳絲雨，段瑞軍，曾 軍， 戴好富，梅文莉，許鳳清*，黃圣卓*

1中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室，?？?571101； 2安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012；3中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所 海南熱帶農業資源研究院，?？?571101

農業農村部“南鋒專項”考察團隊調查發現大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬EuphorbiaLinn.多年生草本植物海濱大戟Euphorbiaatoto為西沙群島島礁特色植物，并且是永樂群島和宣德群島的主要海岸帶優勢植物[1,2]。西沙群島藥用植物資源較為豐富，其中大戟屬的藥用植物也相對較多，且多可作為清熱類草藥[3]。海南沿海當地居民將海濱大戟作為清熱解毒藥物，用于治療痢疾和泄瀉等癥[4]。前期預實驗中發現海濱大戟的粗提物具有較好的抗炎活性，體外能夠抑制脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7產生NO(200 μg/mL濃度下，抑制率為83.97%)。為了了解海濱大戟的主要活性物質，本研究對海濱大戟地上部分進行化學成分及其體外抗炎活性和細胞毒活性研究。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

1.2 儀器設備與試劑

Bruker AV-500型超導核磁共振儀(德國Bruker公司)；ESI-MS質譜儀(德國Bruker amazon SL公司)；CA-1111冷卻水循環裝置(上海愛朗儀器有限公司)；旋轉蒸發儀(德國Heidolph Laborota公司)；MCP 5100旋光儀(奧地利Anton Paar公司)；FDS-2000冷凍干燥機(日本東京理化器械株式會社)；METTLER TOLEDO ME204精密和分析天平[萬分之一，梅特勒-托力多儀器(上海)公司]；Varioskan LUX酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；GALAXYR CO2培養箱(英國RSBiotech公司)；HHB11360-S普通培養箱(上海躍進醫療器械廠)；SW-40超凈工作臺(河流科技有限公司)；UNIQUE-R20純水系統(廈門銳思捷科學儀器有限公司)。

色譜硅膠板G/H/G254、柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；Rp-18(20～45 μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司)；Sephadex LH-20(美國GE Healthcare公司)；常用有機試劑為國產AR級試劑(天津市康科德科技有限公司)；氘代試劑(美國Merck公司)；DMSO(西隴化工股份有限公司)；濃硫酸(山東淄博濱嶺化工有限公司)；精碘(上海SUNHEAT化工公司)；碘顯色劑和5%～10%硫酸-乙醇顯色劑。

小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7)(中國科學院干細胞庫)；人胃癌細胞株(SGC-7901)、人慢性髓原白血病細胞株(K562)、人宮頸癌細胞(Hela)、人肺癌細胞株(A549)和人肝癌細胞株(BEL-7402)(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)；脂多糖(上海碧云天生物技術有限公司，批號S-1732)、4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(上海源葉生物科技有限公司，批號K22J9B64113)、槲皮素(美國默克公司，批號SLBZ4289)、Griess試劑(上海源葉生物科技有限公司，批號L01N10G101815)和四甲基偶氮唑藍(廣州賽國生物科技有限公司，批號EZ2811E134)；DMEM培養基(賽默飛世爾科技公司，批號8120459)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號11011-8611)、丙酮酸鈉(美國賽默飛世爾科技公司，批號2323639)和谷氨酰胺(美國賽默飛世爾科技公司，批號2323475)。

1.3 提取與分離

取新鮮海濱大戟地上部分全草10 kg切碎、晾干、粉碎后，浸泡在95%乙醇(20 L)液中，每3小時回流提取(78 ℃)1次，共提取3次，合并減壓濃縮后得乙醇浸膏(1.23 kg)。浸膏加水混懸，乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮回收溶劑得乙酸乙酯萃取物347 g。乙酸乙酯萃取物340 g，經硅膠柱色譜(200～300目)，石油醚-丙酮(V/V，30∶1→0∶1，每個梯度4 L)梯度洗脫，得12個流份Fr.1～Fr.12。

Fr.3(37.0 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得4個流分Fr.3.1～Fr.3.4。Fr.3.1(2.3 g)經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得10個流分Fr.3.1.1～Fr.3.1.10。Fr.3.1.5(70.0 mg)經硅膠柱色譜石油醚-丙酮(9∶1)洗脫得化合物6(1.8 mg)。Fr.3.3(2.3 g)經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得4個流分Fr.3.3.1～Fr.3.3.4。Fr.3.3.1(383.4 mg)經反復硅膠柱色譜石油醚-丙酮(15∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物5(8.4 mg)。Fr.4(42.0 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得7個流分Fr.4.1～Fr.4.7。Fr.4.3(670 mg)經反復硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(40∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物1(3.1 mg)。Fr.5(29.0 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得3個流分Fr.5.1～Fr.5.3。Fr.5.2(4.3 g)經反復硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物16(4.9 mg)和15(5.7 mg)。Fr.5.3(11.7 g)經反復硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(8∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物17(2.1 mg)。Fr.6(5.8 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得5個流分Fr.6.1～Fr.6.5。Fr.6.3(1.1 g)經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得3個流分Fr.6.3.1～Fr.6.3.3。Fr.6.3.3(73.7mg)經硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(3∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)，重結晶得到化合物2(7.8 mg)。Fr.8(3.1 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得6個流分Fr.8.1～Fr.8.6。Fr.8.3(40.3 mg)經硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫得化合物4(1.8 mg)。Fr.8.5(96 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得4個流分Fr.8.5.1～Fr.8.5.4。Fr.8.5.1(130 mg)經硅膠柱色譜，石油醚-氯仿-丙酮(10∶10∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物10(8.8 mg)。Fr.9(4.2 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得3個流分Fr.9.1～Fr.9.3。Fr.9.2(142.3 mg)經硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(50∶1)洗脫得化合物9(3.3 mg)和11(3.9 mg)。Fr.9.3(132.2 mg)經Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得3個流分Fr.9.3.1～Fr.9.3.3。Fr.9.3.2(78 mg)經硅膠柱色譜，石油醚-氯仿-丙酮(3∶1∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物18(7.6 mg)和3(2.6 mg)。Fr.9.3.3(16.3 mg)經硅膠柱色譜，石油醚-氯仿-丙酮(5∶1∶1)洗脫，再經Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物14(4.2 mg)、13(4.3 mg)和7(3.6 mg)。Fr.10(2.3 g)經Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得5個流分Fr.10.1～Fr.10.5。Fr.10.2(341 mg)經硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(50∶1)洗脫得化合物8(2.3 mg)。Fr.10.3(63.2 mg)經硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(60∶1)洗脫得化合物12(3.3 mg)。

1.3 化合物的體外抗炎活性及細胞毒活性研究

體外抗炎活性實驗以槲皮素為陽性對照，采用脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7)，分別設置LPS誘導組、空白對照組和實驗組。將待測樣品分為5個濃度梯度：100、75、50、25和12.5 μmol/L。選取生長良好的RAW 264.7細胞，取100 μL細胞液以5 × 104個/mL密度接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上濕度條件下培養24 h，分別加入50 μL LPS(終濃度0.5 μg/mL)和50 μL待測化合物溶液(100～12.5 μmol/L)。繼續培養24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后向每孔加入100 μL的Griess試劑。在酶標儀540 nm波長下檢測并記錄每孔的OD值(吸光度)，采用Griess法測定化合物對NO釋放的抑制率，繪制化合物濃度-抑制率曲線圖，計算半數抑制濃度(IC50值)[5-7]。

采用MTT法對化合物的細胞毒活性進行篩選：實驗所用腫瘤細胞系為K562、BEL-7402、SGC-7901、A549及Hela，以鹽酸阿霉素為陽性對照，DMSO為陰性對照。根據初篩抑制率設置待測化合物濃度(100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)。分別在96孔板上接種100 μL濃度約5 × 104個/mL的待測細胞，培養24 h后(培養條件：37 ℃、5% CO2、90%以上濕度，含有10%小牛血清的四甲基偶氮唑藍培養)，加入100 μL待測化合物溶液培養72 h后觀察細胞形態。再向每孔細胞中加入15 μL(5 mg/mL)的MTT溶液，37 ℃條件下反應4 h后吸棄上清液，繼續向每孔加入100 μL的DMSO，使其充分溶解。在酶標儀490 nm波長下檢測并記錄每孔的OD值(吸光度)，計算腫瘤細胞生長抑制率及半數抑制濃度(IC50值)[8]。

比較文學的理論和方法，新加坡學界其實并不陌生。早在1973年，本地學者王潤華教授便已在南洋大學開設了“比較文學概論”和“西方漢學研究”的課程，向中文系學生介紹比較文學的學科理論和研究方法，進而引導學生將它們應用到中國文學的研究上?；仡欉@段教學經歷，王潤華教授有這樣的描述：

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

表1 化合物1的核磁1H和13C NMR數據(500和125 MHz，CDCl3)Table 1 The 1H and 13C NMR date of compound 1(500 and 125 MHz，CDCl3)

圖1 化合物1的關鍵2D NMR相關信號Fig.1 Key 2D NMR correlations of compound 1

化合物3黃色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z287.1 [M+H]+，分子式C15H10O6；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.11(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，-6′)，7.93(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，-5′)，6.42(1H，s，H-8)，6.21(1H，s，H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：146.9(C-2)，136.5(C-3)，176.1(C-4)，160.8(C-5)，98.3(C-6)，165.4(C-7)，94.0(C-8)，158.8(C-9)，103.5(C-10)，121.9(C-1′)，129.2(C-2′，-6′)，115.8(C-3′，-5′)，159.7(C-4′)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物3為山柰酚。

化合物4白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z413.3 [M+H]+，分子式C28H44O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，d，J= 5.5 Hz，H-7)，5.25(1H，dd，J= 15.1，7.4 Hz，H-23)，5.18(1H，dd，J= 15.1，8.2 Hz，H-22)，1.11(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)，0.94(3H，d，J= 6.9 Hz，H-27)，0.88(3H，d，J= 6.2 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 7.5 Hz，H-21)，0.62(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：31.7(C-1)，31.0(C-2)，67.9(C-3)，39.6(C-4)，37.3(C-5)，73.8(C-6)，117.7(C-7)，144.2(C-8)，76.1(C-9)，43.9(C-10)，23.1(C-11)，39.4(C-12)，43.6(C-13)，54.9(C-14)，22.8(C-15)，28.1(C-16)，56.1(C-17)，12.5(C-18)，19.0(C-19)，40.6(C-20)，22.2(C-21)，132.3(C-22)，135.5(C-23)，43.0(C-24)，33.2(C-25)，19.8(C-26)，20.1(C-27)，17.7(C-28)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物4為6，9-環氧-麥角甾-7，22-二烯-3-醇。

化合物11白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z566.4 [M+H]+，分子式C30H55N5O5；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.34～8.01(5H，m，-NH-7，-14，-21，-28，-35)，4.58(1H，m，H-30)，4.47(1H，m，H-23)，4.17(1H，m，H-2)，4.13(1H，m，H-16)，0.97(3H，s，H-34)，0.96(3H，s，H-27)，0.96(3H，s，H-20)，0.95(3H，s，H-13)，0.95(3H，s，H-6)，0.94(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-33)，0.91(3H，s，H-26)，0.90(3H，s，H-5)，0.89(3H，s，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：172.4(C-1)，57.1(C-2)，38.9(C-3)，25.0(C-4)，10.9(C-5)，15.8(C-6)，173.7(C-8)，59.4(C-9)，36.4(C-10)，25.5(C-11)，10.8(C-12)，15.7(C-13)，172.3(C-15)，54.0(C-16)，39.9(C-17)，25.4(C-18)，22.4(C-19)，22.8(C-20)，172.5(C-22)，52.4(C-23)，41.7(C-24)，25.3(C-25)，23.0(C-26)，22.1(C-27)，173.6(C-29)，51.9(C-30)，39.7(C-31)，25.2(C-32)，22.9(C-33)，22.0(C-34)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物11為viscumamide。

化合物13黃色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z193.1 [M+H]+，分子式C10H8O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.88(1H，d，J= 9.4 Hz，H-4)，7.13(1H，s，H-8)，6.79(1H，s，H-5)，6.23(1H，d，J= 9.4 Hz，H-3)，3.90(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：164.1(C-2)，112.6(C-3)，146.1(C-4)，108.1(C-5)，146.5(C-6)，147.1(C-7)，104.0(C-8)，151.4(C-9)，110.0(C-10)，56.8(6-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物13為scopoletin。

化合物14白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z225.1 [M+H]+，分子式C13H20O3；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.77～5.90(3H，m，H-4，-7，-8)，4.34(1H，m，H-9)，2.50(1H，d，J= 16.9 Hz，H-2b)，2.18(1H，d，J= 16.9 Hz，H-2a)，1.93(3H，d，J= 1.3 Hz，H-11)，1.26(3H，d，J= 6.5 Hz，H-10)，1.06(3H，s，H-13)，1.04(3H，s，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：42.4(C-1)，50.7(C-2)，201.2(C-3)，127.1(C-4)，167.5(C-5)，80.0(C-6)，136.9(C-7)，130.0(C-8)，68.7(C-9)，23.8(C-10)，19.6(C-11)，23.5(C-12)，24.5(C-13)。以上數據與文獻[22]報道基本一致，故鑒定化合物14為corchoionol C。

化合物15淡黃色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z176.1 [M+H]+，分子式C10H9O2N；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：8.07(1H，d，J= 6.7 Hz，H-4)，7.98(1H，s，H-2)，7.43(1H，d，J= 6.9 Hz，H-7)，7.23(1H，dd，J= 7.2，5.7 Hz，H-5)，7.20(1H，dd，J= 7.0，5.8 Hz，H-6)，3.90(3H，s，-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：133.2(C-2)，108.2(C-3)，121.9(C-4)，122.5(C-5)，123.7(C-6)，112.9(C-7)，168.8(C-8)，127.3(C-3′)，138.1(C-7′)，51.4(9-OCH3)。以上數據與文獻[23]報道基本一致，故鑒定化合物15為吲哚-3-甲酸甲酯。

化合物16褐色固體(CHCl3)；ESI-MS：m/z195.1 [M+H]+，分子式C10H10O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：11.01(1H，s，-OH)，7.57(1H，dd，J= 8.4，7.4 Hz，H-5)，7.05(1H，d，J= 7.4 Hz，H-4)，7.01(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6)，4.65(1H，m，H-3)，4.64(1H，m，H-1′)，1.54(3H，d，J= 5.7 Hz，H-2′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：168.7(C-1)，69.3(C-3)，116.3(C-4)，137.0(C-5)，118.0(C-6)，162.2(C-7)，106.8(C-8)，141.3(C-9)，80.1(C-1′)，18.1(C-2′)。以上數據與文獻[24]報道基本一致，故鑒定化合物16為3ξ-(1ξ-羥基)-7-羥基-1-苯并異呋喃酮。

化合物17白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z145.1 [M+Na]+，分子式C7H6O2；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.91(1H，s，-CHO)，7.83(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2，-6)，7.01(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3，-5)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：161.2(C-1)，116.1(C-2，-6)，132.5(C-4)，130.4(C-3，-5)，190.8(C-7)。以上數據與文獻[25]報道基本一致，故鑒定化合物17為對羥基苯甲醛。

化合物18白色針晶(MeOH)；ESI-MS：m/z317.3 [M+H]+，分子式C18H36O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.39(2H，m，9，10-OH)，2.29(2H，t，J= 7.4 Hz，H-2)，0.97～1.56(28H，m)，0.92(3H，t，J= 7.0 Hz，H-18)；13C MR(125 MHz，CDCl3)δ：177.7(C-1)，33.9(C-2)，27.0(C-3)，34.0(C-8)，75.3(C-9/10)，75.2(C-9/10)，35.0(C-11)，33.1(C-12)，30.2～30.8(C-4，-7，-13，-14)，27.1(C-15)，26.2(C-16)，23.7(C-17)，14.4(C-18)。以上數據與文獻[26]報道基本一致，故鑒定化合物18為9,10-二羥基十八烷酸。

化合物1～18的化學結構見圖2。

圖2 化合物1～18的化學結構Fig.2 Chemical structures of compounds 1-18

2.2 化合物的活性研究結果

實驗初期對海濱大戟的粗提物進行抗炎活性測試，發現提取物具有較好的體外抑制脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7產生NO的活性(200 μg/mL濃度下，抑制率為83.97%)，同時其對小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7具有較強的細胞毒性(200 μg/mL濃度下，細胞毒性為96.55%)，說明在海濱大戟中可能同時存在具有抗炎癥活性成分和細胞毒活性成分。

化合物1～18進行體外抗炎活性測試，除化合物2具有較好的抑制LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7產生NO的活性(IC5024.81 ± 1.58 μmol/L)外，其他化合物均沒有此活性，陽性對照IC50為15.23 ± 0.65 μmol/L；MTT法測試了18個化合物對K562、BEL-7402、SGC-7901、A549和Hela五種腫瘤細胞系的體外生長抑制作用(以鹽酸阿霉素為陽性對照：K562 IC500.07 ± 0.01 μmol/L、BEL-7402 IC500.47 ± 0.01 μmol/L、SGC-7901 IC500.22 ± 0.01 μmol/L、A549 IC500.47 ± 0.03 μmol/L和Hela IC500.28 ± 0.01 μmol/L)，顯示所篩選的化合物對以上五種腫瘤細胞均無活性。

3 討論與結論

在前期研究基礎上[27]，我們對海濱大戟的化學成分及藥理活性進行了研究，從乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離到包括倍半萜、黃酮、甾體、三萜、肽類以及其他結構類型化合物共計18個，并發現了一個抗炎癥活性化合物6β-羥基肉桂內酯(2)。本研究得到的18個化合物均為首次從海濱大戟中分離得到，其中除化合物10、13、14和17外，其他化合物還是首次在大戟屬分離得到，化合物1為一個新天然產物，本文中對該化合物的相關核磁數據進行了補充。通過本研究，基本了解了海濱大戟乙酸乙酯提取物的主要化學成分，為海濱大戟在民間藥用提供了一定的科學依據。

致謝：化合物的波譜數據由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所海南省黎藥資源天然產物研究與利用重點實驗室測試中心測定。