α-倒捻子素通過激活ROS/p38 MAPK/Bax級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)B淋巴瘤Ramos細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

蔡紫微，孫毅松，汪 林， 廖玉嬌，余 歡，黃 敏，李潤滋，李敏惠

1成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2成都醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；3成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院； 4成都醫(yī)學(xué)院科研實驗中心，成都 610500

B淋巴瘤(B lymphoma)是血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，化療是B淋巴瘤的主要治療手段，臨床常用藥物包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿等?；熌苡行Ц纳屏馨土龌颊叩纳媛始邦A(yù)后，但仍存在高毒性、高副作用和易耐藥等缺點[1,2]。從天然產(chǎn)物中尋找安全低毒的有效藥物是抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。研究學(xué)者們從植物來源的中藥中分離并鑒定具有抗淋巴瘤活性的天然化合物，同時探究其分子作用機(jī)制，如從紅豆蔻、黃芩中分離得到黃酮類化合物楊梅素和黃芩素，經(jīng)驗證二者分別通過靶向bruton tyrosine kinase(BTK)及PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抗淋巴瘤作用[3]。莽吉柿(GarciniamangostanaL.)俗稱山竹、倒捻子等，素有"水果皇后"的美譽(yù)。山竹果殼含有黃酮類化合物、呫噸酮類化合物、花色苷、原花青素等活性成分，在某些東南亞地區(qū)常作為傳統(tǒng)藥物用于治療腹瀉、痢疾、感染等疾病[4,5]。α-倒捻子素(α-mangostin，α-Ma)是一種氧雜蒽酮類化合物，具有多種生物學(xué)活性，是山竹果殼主要活性成分之一。研究顯示，α-Ma具有潛在抗癌性能，對胃癌、乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等均表現(xiàn)出抑制活性[6]。然而，α-Ma對B淋巴瘤的增殖抑制作用及其分子作用機(jī)制尚未見報道?；诖?，本研究以人B淋巴瘤Ramos細(xì)胞為研究對象，觀察α-Ma對Ramos細(xì)胞增殖、凋亡的影響，旨在探討α-Ma對B淋巴瘤的增殖抑制作用及其潛在分子作用機(jī)制，為α-Ma的抗腫瘤活性提供新見解，為基于α-Ma的類似物改造及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物

α-倒捻子素(Cat.No.A0406，純度≥98%)購自成都曼思特生物科技公司，化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子式見圖1。

圖1 α-Ma的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of α-Ma

1.2 主要試劑

胎牛血清(Cat.No.10100147)、RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Cat.No.72400047)購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒(Cat.No.CK04)購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Cat.No.C1062L)、線粒體膜電位檢測試劑盒(Cat.No.C2006)、ROS檢測試劑盒(Cat.No.S0033M)、RIPA強(qiáng)效裂解液(Cat.No.P0013B)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cat.No.BL521A)購自中國白鯊(Biosharp)科技有限公司；ECL發(fā)光液(Cat.No.WBULS0500)購自美國Millipore公司；caspase-9(Cat.No.9502)、cleaved caspase-9(Cat.No.9505)、caspase-3(Cat.No.9662)、cleaved caspase-3(Cat.No.9664)、cleaved PARP(Cat.No.5625)、Bim(Cat.No.2933)、Bax(Cat.No.5023)、p-p38 MAPK(Cat.No.4511)、GAPDH(Cat.No.5174)、偶聯(lián)辣根過氧化物酶的anti-rabbit IgG(Cat.No.7074)購自美國CST公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人B淋巴瘤Ramos細(xì)胞(成都醫(yī)學(xué)院鄒強(qiáng)教授饋贈)，保存于成都醫(yī)學(xué)院科研實驗中心，其STR鑒定結(jié)果與ATCC一致。根據(jù)ATCC推薦的培養(yǎng)方法，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞增殖抑制實驗

Ramos細(xì)胞以2×104個/孔的密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入供試的α-Ma，藥物作用濃度分別為0、7.5、10、15、20、30、40 μmol/L，每個濃度設(shè)置三個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔；藥物作用24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑；孵育2～4 h后，用酶標(biāo)儀(BioTek Powerwave XS，美國)檢測450 nm處的OD值。按照以下公式計算相應(yīng)藥物濃度下細(xì)胞的抑制率。通過GraphPad Prism 9.0軟件繪制細(xì)胞生長抑制曲線，并計算α-Ma對Ramos細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 活性氧檢測

Ramos細(xì)胞以6×105個/孔的密度接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；加入α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)處理12 h后，收集細(xì)胞并用DCFH-DA熒光探針37 ℃避光染色20 min；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)離心洗滌兩次，使用流式細(xì)胞儀(ACEA NovoCyte，美國)檢測DCF熒光并分析細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細(xì)胞24 h后，于倒置顯微鏡20×物鏡下(Olympus，日本)觀察Ramos細(xì)胞的形態(tài)變化；觀察到細(xì)胞有明顯凋亡樣形態(tài)改變后，離心收集所有細(xì)胞，用含Annexin V-FITC/PI兩種熒光染料的結(jié)合液重懸細(xì)胞，避光染色20 min；流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7 線粒體膜電位檢測

α-Ma處理Ramos細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞；用含有JC-1熒光探針的染色液重懸細(xì)胞，37 ℃避光染色20 min；離心洗滌兩次，PBS重懸，用流式細(xì)胞儀采集染色后的細(xì)胞并分析線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改變情況。

1.8 蛋白免疫印跡

α-Ma處理Ramos細(xì)胞24 h后，用RIPA強(qiáng)效裂解液(已加蛋白酶及磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞，4 ℃離心收集蛋白上清，通過BCA法測定蛋白濃度；采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot，WB)分析細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路蛋白caspase-3/-9、cleaved caspase-3/-9、cleaved PARP、Bim、Bax、p-p38 MAPK的表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參，用Image Lab軟件(美國Bio-Rad公司)分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 α-Ma抑制Ramos細(xì)胞增殖

α-Ma作用Ramos細(xì)胞24 h和48 h后，通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力；利用GraphPad Prism 9.0軟件繪制細(xì)胞生長抑制曲線，并計算α-Ma對Ramos細(xì)胞的IC50值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-Ma以藥物濃度依賴和時間依賴的方式抑制Ramos細(xì)胞增殖，其24 h和48 h的IC50值分別為14.84 μmol/L和8.087 μmol/L(見圖2)。

圖2 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞的生長抑制作用Fig.2 Growth inhibitory effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells

2.2 α-Ma誘導(dǎo) Ramos細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細(xì)胞12 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)DCFH-DA熒光探針染色的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ramos細(xì)胞內(nèi)ROS水平以α-Ma濃度依賴的方式增加，分別為(2.05±0.26)%、(6.38±0.05)%、(13.20±0.14)%、(20.71±0.5)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。

2.3 α-Ma誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡

α-Ma作用Ramos細(xì)胞24 h后，采用倒置顯微鏡觀察Ramos細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-Ma誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞形態(tài)發(fā)生典型的凋亡樣改變，0 μmol/Lα-Ma組Ramos細(xì)胞形態(tài)分明，飽滿透亮，15 μmol/Lα-Ma組Ramos細(xì)胞胞體收縮、出泡，細(xì)胞拉長出現(xiàn)釘狀突起，部分細(xì)胞細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解(見圖4)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的方式之一。α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測分析發(fā)現(xiàn)位于Q4-2區(qū)(表示晚期凋亡細(xì)胞)和Q4-4區(qū)(表示早期凋亡細(xì)胞)的總凋亡細(xì)胞比例分別為(5.92±0.25)%、(12.58±1)%、(42.84±2.05)%、(71.9±1.78)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5A)。同時，WB結(jié)果顯示α-Ma下調(diào)caspase-3/-9的表達(dá)，上調(diào)cleaved caspase-3/-9和cleaved PARP的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖5C)。結(jié)果提示α-Ma可誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡。

圖3 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.3 Effect of α-Ma on intracellular ROS level in B lymphoma Ramos cells注：A：流式細(xì)胞儀檢測并分析5 000個經(jīng)DCFH-DA染色的Ramos細(xì)胞；B：和0 μmol/L α-Ma組比較， **P<0.01。Note:A:Analysis of 5 000 DCFH-DA-stained Ramos cells by flow cytometry.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,**P<0.01.

圖4 α-Ma作用后Ramos細(xì)胞形態(tài)學(xué)成像Fig.4 Morphological imaging of Ramos cells induced by α-Ma

圖5 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)Fig.5 Apoptosis-inducing effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells注：A：流式細(xì)胞儀檢測并分析5 000個經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染的Ramos細(xì)胞；C：WB檢測α-Ma對Ramos細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B和D：和0 μmol/L α-Ma組比較， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells double-stained with Annexin V-FITC/PI was detected by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on apoptosis-related protein expression of Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.4 線粒體途徑參與α-Ma誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡

MMP的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件，JC-1熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以反映細(xì)胞MMP的改變。使用流式細(xì)胞儀檢測JC-1染色后的Ramos細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞MMP分別降低(4.17±0.49)%、(44.02±2.5)%、(69.76±3.50)%、(92.64±3)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6A)。同時，通過WB檢測線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，α-Ma誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bim、Bax表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖6C)。提示線粒體途徑參與α-Ma誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡。

圖6 α-Ma通過線粒體途徑誘導(dǎo)B淋巴瘤Ramos細(xì)胞凋亡Fig.6 α-Ma induces apoptosis in B lymphoma Ramos cells via the mitochondrial pathway注：A：流式細(xì)胞儀檢測分析5 000個JC-1熒光染色的Ramos細(xì)胞；C：WB檢測α-Ma對Ramos細(xì)胞線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B和D：和0 μmol/L α-Ma組比較， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells stained with JC-1 fluorescent probe were detected and analyzed by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on the expression of mitochondrial pathway-related proteins in Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.5 p38 MAPK參與α-Ma對Ramos細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程

p38 MAPK參與細(xì)胞多種生理和病理過程，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞周期和機(jī)體的炎癥反應(yīng)等。通過WB檢測發(fā)現(xiàn)α-Ma能誘導(dǎo)p38 MAPK活化，即上調(diào)p-p38 MAPK的表達(dá)，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖7)。研究結(jié)果提示p38 MAPK參與α-Ma對Ramos細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)過程。

圖7 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞p38 MAPK的影響Fig.7 Effect of α-Ma on p38 MAPK in B lymphoma Ramos cells注：A：WB檢測α-Ma對Ramos細(xì)胞p38 MAPK表達(dá)的影響；B：和0 μmol/L α-Ma組相比， *P<0.05。Note:A:The effect of α-Ma on the expression of p38 MAPK in Ramos cells was detected by WB.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05.

3 討論與結(jié)論

從天然產(chǎn)物中分離提取的未經(jīng)修飾的化合物有著多靶點、安全性高、廣泛易得等優(yōu)點，在治療腫瘤方面展示出良好的優(yōu)勢[7,8]。據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)有抗腫瘤藥物中約60%是天然產(chǎn)物或來源于天然產(chǎn)物，如紫杉醇、長春新堿[9]。α-Ma來源于天然產(chǎn)物山竹，已被報道通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。α-Ma通過JNK和AKT通路誘導(dǎo)軟骨肉瘤細(xì)胞凋亡[10]；通過ERK和p38通路誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞凋亡[11]；通過JNK和p38通路抑制乳腺癌增殖[12]；通過自噬促進(jìn)胃癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[13]等。在本項研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)了α-Ma對B淋巴瘤Ramos細(xì)胞的增殖抑制作用，α-Ma以藥物濃度依賴和時間依賴的方式抑制淋巴瘤Ramos細(xì)胞增殖。

ROS水平過高，可引起機(jī)體DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p38 MAPK是MAPK家族中的重要成員，p38 MAPK的活化在多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的過程發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以磷酸化激活p38 MAPK，進(jìn)而誘導(dǎo)Bcl-2家族成員Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體外膜[14,15]。Bax轉(zhuǎn)位至線粒體膜可擴(kuò)大通透性孔道，改變線粒體內(nèi)外室的質(zhì)子梯度，降低線粒體跨膜電位，釋放促凋亡物質(zhì)(如AIF和Cyt-c)。Cyt-c釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡酶激活因子(Apaf-1)相互作用，并在ATP和dATP的協(xié)助下形成凋亡復(fù)合體，凋亡復(fù)合體招募并激活pro-caspase-9，活化的caspase-9進(jìn)一步激活caspase-3/7，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，切割PARP等底物，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Bim作為Bcl-2家族另一成員，通過直接結(jié)合或競爭結(jié)合兩種方式促進(jìn)Bax的活化[17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-Ma能增加Ramos細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低MMP，同時能上調(diào)p-p38、Bax、Bim的表達(dá)，活化caspase-3/9和PARP，誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞凋亡。

根據(jù)以上結(jié)果，我們推測α-Ma抑制淋巴瘤Ramos細(xì)胞增殖的可能機(jī)制是α-Ma活化ROS/p38 MAPK/Bax級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)B淋巴瘤細(xì)胞凋亡。研究闡述了α-Ma的抗B淋巴瘤活性及其可能機(jī)制，為以α-Ma為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新思路。