外周血單個核細胞中miRNA在感染性疾病中差異表達的研究進展

鐘嬋麗 綜述，鄭碧英，徐軍發(fā) 審校

(廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院檢驗醫(yī)學研究所，廣東東莞 523808)

微RNA(microRNA，miRNA/miR)是真核生物中廣泛存在的轉錄本長度為22～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠特異性結合編碼基因的mRNA的3′UTR區(qū)，阻止基因翻譯或促進mRNA降解，從而在轉錄后水平負調控靶基因的表達。它們通過調控基因表達，在先天免疫、細胞周期、生長、增殖、凋亡和新陳代謝等多種細胞生理活動中發(fā)揮重要作用[1]。有研究發(fā)現，疾病發(fā)展過程或不同疾病亞型中miRNA表達水平有明顯變化，提示它們與疾病發(fā)生、發(fā)展相關，可能是新型的診斷生物標志物和藥物治療靶點[2-3]。由于外周血獲取方便，且外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)提取技術成熟。miRNA在PBMCs中含量豐富，參與調控PBMCs的功能，能在一定程度上反映免疫細胞對抗外源細菌、病毒等微生物入侵情況。隨著PBMCs提取技術日趨成熟及微陣列技術和高通量測序的出現，PBMCs的miRNA檢測效率大大增高且成本降低。此外，相比于傳統蛋白標志物，miRNA在PBMCs中表達穩(wěn)定，不易降解；且具有準確率高，易于實現多組分同時檢測的優(yōu)越性。因此，本文詳述PBMCs中的miRNA在感染性疾病中差異表達及其可能在臨床診斷中扮演的角色，為PBMCs中的miRNA可能成為新的疾病診斷標志物提供理論依據。

1 miRNA簡介

1.1 miRNA的生物合成過程及功能

1993年AMBROS等首次在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現非編碼蛋白基因miRNA[1]。隨著越來越多的miRNA及其調控靶點和功能的發(fā)現，miRNA逐漸成為表觀遺傳學范疇的研究熱點，是醫(yī)學和細胞生物學史上的主要突破之一。成熟miRNA的產生較為復雜，它們絕大部分定位于基因間隔區(qū)，小部分位于蛋白編碼基因的內含子，經RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成長度為300～1 000個堿基的pri-miRNA，pri-miRNA在細胞核經過Drosha酶酶切，形成70～90個堿基的帶有莖環(huán)結構的miRNA前體(pre-miRNA)，pre-miRNA在Exportin-5協助下轉運到細胞質，由Dicer酶酶切后，成為長20～24個核苷酸的miRNA雙鏈。隨后miRNA雙鏈的一條鏈加載到RNA誘導的沉默復合體(RISC)中，結合靶mRNA的3′UTR，誘導靶mRNA的降解或翻譯抑制。

miRNA的主要功能是進行轉錄后調控。miRNA的表達水平在不同組織和不同發(fā)育階段具有明顯差異，其調控人類基因組中30%的蛋白編碼基因。研究表明，miRNA與靶mRNA并非一對一的特異性結合，每個miRNA參與多個mRNA的轉錄后水平調控，特定的mRNA序列也受多個miRNA調控，從而組成錯綜復雜的調控網絡，在各種生物過程中發(fā)揮著重要作用[4]。

1.2 miRNA作為潛在的臨床診斷輔助標志物的優(yōu)越性

研究表明，miRNA參與調控細胞增殖、分化和凋亡等正常生理過程，miRNA的表達異常會影響細胞功能和正常調控網絡[5]，提示它們的表達變化與臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，可能是潛在的一種輔助診斷標志物。實時熒光定量PCR是miRNA檢測和定量的金標準，它能夠檢測到miRNA之間最小的1個核苷酸差異，可從少量血液標本、細胞和組織中進行檢測，具有高靈敏度和高精確性。近年來，隨著測序技術的高速發(fā)展，微陣列技術和高通量測序出現使miRNA的檢出手段和檢測通量進一步提高，大大節(jié)省了檢測時間和精力[6]。相比于傳統mRNA檢測，miRNA體積小且在體液中穩(wěn)定，能抵抗內源性核糖核酸酶的降解；而相比于蛋白質生物標志物，miRNA檢測分析成本更低，靈敏度和特異度更好，易于實現多組分同時檢測；且具有在外周血中表達穩(wěn)定，在室溫下孵育≥24 h、反復凍融(可高達8個凍融周期)、過酸、過堿，甚至煮沸條件下不易降解等優(yōu)點，因此，miRNA被認為是更理想的診斷標志物[2,7]，其作為生物標志物的潛在用途成為當前研究的熱點。

2 PBMCs中的miRNA

PBMCs是指從外周血中分離出來的，被鑒定為具有圓形核的血細胞，包括淋巴細胞[T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞]、單核細胞和樹突狀細胞等。外周血獲取方便，且分離純化這些細胞的技術成熟[8]。相較于血清，PBMCs提取純化相對較復雜，但在miRNA水平及靈敏度方面更具優(yōu)勢[9-10]，因此，它們常作為疾病和科學研究檢測的首選標本之一。PBMCs含T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞和樹突狀細胞等免疫細胞，它們是機體對抗細菌、病毒等入侵的重要屏障。而miRNA能調節(jié)宿主對病毒、細菌和真菌的防御機制，參與轉錄后基因表達調控的重要途經，調控免疫細胞增殖、分化和凋亡等生理和病理過程。因此，檢測miRNA在PBMCs中的表達水平變化可作為疾病診斷和預測疾病進展的重要判斷。

3 PBMCs中miRNA在感染性疾病中差異表達的研究進展

感染性疾病是由病原微生物感染人體引起的有傳染性的疾病，主要包括細菌、病毒和螺旋體等，檢出病原體是確診的重要依據。由于此類疾病嚴重危害公共衛(wèi)生健康，快速診斷和早期治療對于控制傳染病擴散尤為重要。本文對幾種重要感染性疾病患者PBMCs中miRNA差異表達的研究進行總結。

3.1 結核病

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性感染性疾病，可侵襲多個器官，以肺部感染最為常見。據估計，90%～95%結核感染為無癥狀的潛伏期結核病患者，10%的潛伏期結核病患者會出現內源性復發(fā)，進展為活動性結核病[11]。快速診斷活動性結核病是預防結核傳播的有效措施，痰涂片抗酸染色檢測和痰培養(yǎng)出結核分枝桿菌是診斷結核病的金標準，然而痰涂片抗酸染色不能區(qū)分結核分枝桿菌還是其他抗酸桿菌，特異度低，痰培養(yǎng)費時較長且陽性率僅為30%，目前缺乏快速安全的新型臨床診斷方法[9]。

結核分枝桿菌感染后miRNA差異表達，調節(jié)與炎癥、自噬、凋亡和巨噬細胞活化有關的宿主信號通路。實驗表明，宿主誘導的miRNA增強自噬等抗菌過程，以限制細菌增殖[12]。PBMCs是清除毒性結核分枝桿菌的免疫細胞的主要來源，大量研究發(fā)現，結核病患者的PBMCs中miR-144*、miR-29a、miR-196b-5p、miR-423-5p、miR-140表達上調[13-17]，miR-155-5p、miR-23a-3p表達下調[18]，其中miR-23a-3p、miR-144*、miR-29a、miR-423-5p、miR-155-5p調節(jié)結核病感染宿主細胞的自噬和凋亡，而miR-223、miR-196b-5p、miR-140調節(jié)炎性細胞因子和趨化因子的產生和刺激調節(jié)巨噬細胞的活化，其與菌株的致病性和抗結核病免疫反應有關，這說明miRNA可用于結核病的輔助診斷。進一步臨床研究證實miR-125b和miR-31具有單獨診斷肺結核的價值，且在結核病患者中miR-125b表達下調與痰抗酸桿菌涂片有關[19]。兒童結核病患者PBMCs中miR-31表達水平明顯低于正常兒童(P<0.05)，其診斷的靈敏度和特異度均高于90%[20]。因此，miR-31有可能成為兒童結核病患者的診斷標志物。

除肺結核外，miRNA或許可作為結核性腦膜炎的新型輔助診斷標志物。結核性腦膜炎是中樞神經系統結核病最常見和最嚴重的形式，目前臨床尚缺具有特異性和有效性的診斷方法，因此，很難與其他常見類型的腦膜炎，尤其是病毒性腦膜炎區(qū)分[21]。而miRNA則可能具有該功能，研究發(fā)現miR-29a、miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p可能具有分別診斷結核性腦膜炎的價值(曲線下面積>0.7)。特別是miR-29a，在結核性腦膜炎患者的PBMCs中表達上調，診斷的靈敏度和特異度分別為67.2%和88.5%[15]。此外，miR-126-3p、miR-130a-3p、miR-151a-3p和miR-199a-5p表達下調，它們用于診斷結核性腦膜炎和區(qū)分結核性腦膜炎和病毒性腦膜炎的效能最高(曲線下面積=0.893)，靈敏度和特異度分別為90.6%和86.7%[21]。

此外，活動性肺結核和結核性腦膜炎的早期鑒別和治療有益于控制結核病傳播和減少后遺癥。既往研究發(fā)現，活動性結核病患者、潛伏期結核病患者、健康受試者和接種卡介苗受試者的PBMCs miRNA表達譜不同，表明miRNA還可能用于結核病的分型[7,22]。活動性結核病、潛伏期結核病患者和健康受試者的miRNA微陣列結果顯示，3組間有17個miRNA差異表達，其中miR-424和miR-365上調可用于鑒別活動性結核病和潛伏期結核病患者[23]。目前尚缺乏區(qū)分潛伏期結核分枝桿菌是否被根除的診斷標準，難以識別出潛伏期結核病患者中出現結核復發(fā)的高風險人群，miRNA的表達是否能夠反映潛伏期不同階段對結核病感染的反應可能也是未來的研究方向之一。

3.2 病毒性肝炎

病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的，以肝臟損害為主要表現的傳染病。其中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染最為常見，通過肝炎病毒學檢測確診。HBV相關疾病的嚴重程度差異很大，宿主免疫應答和病毒復制之間的相互作用決定了HBV感染的臨床結局，90%～95%的成年HBV感染者能有效清除病毒，5%～10%發(fā)展為慢性感染，約1%發(fā)展為高致死率的重癥乙型肝炎。慢性HBV感染可導致嚴重的肝功能障礙和疾病，高達20%～30%的慢性乙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化或肝癌。因此，尋找早期診斷肝損傷、預測進展的無創(chuàng)診斷標志物對肝癌和HBV相關慢加急性肝衰竭具有重要的臨床意義。

丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)是最廣泛使用的肝損傷酶學指標，但并不是特異性指標，因為它們在一些其他疾病也會出現升高現象。且在病理學檢查中，這兩個標志物與組織形態(tài)學改變也并不完全一致。因此，開發(fā)探索新的輔助診斷方法對于該疾病的診斷具有重大意義。研究發(fā)現，PBMCs中miRNA的表達譜與HBV相關疾病的嚴重程度密切相關[24]。如慢性乙型肝炎患者中miR-212-3p、miR-155、miR-146a、miR-548及miR-4804-5p表達上調，導致慢性HBV感染和肝損傷，因為在慢性乙型肝炎中這些miRNA參與調控免疫應答和病毒的免疫逃逸功能[25-28]。相比于HBV復制活躍而ALT正常的免疫耐受的慢性乙型肝炎患者，HBV病毒載量減少但ALT升高的免疫激活慢性乙型肝炎患者中miR-548和miR-4804-5p表達也明顯上調[28]，提示可能是識別慢性乙型肝炎患者不同免疫階段和預測慢性乙型肝炎導致的肝損傷的生物標志物。此外，慢性乙型肝炎患者外周血自然殺傷細胞中表達下調的miR-146a，在肝癌患者中進一步下降，抑制體內抗腫瘤免疫反應[24]，可用于早期診斷HBV相關肝癌。

HBV相關慢加急性肝衰竭是一種涉及肝功能急性惡化且影響多個器官的綜合征，研究發(fā)現相對于慢性乙型肝炎患者，miR-21-5p、miR-34c-5p、miR-143-3p、miR-143-5p、miR-374a-3p和miR-542-3p等在HBV相關慢加急性肝衰竭患者PBMCs中表達上調，提示其可能是診斷診斷和預測HBV相關急性肝衰竭進展的指標[29]。雖然目前對于HBV相關疾病的PBMCs中miRNA的研究已取得一定成績，但上述miRNA研究樣本量仍較少，還需在大型隊列中進行驗證，并比較此類miRNA與血清肝損傷酶學指標用于診斷慢性HBV患者肝損傷的準確度。此外，目前HBV相關肝癌診斷相關的miRNA研究標本采集主要在血清、肝組織，血清標本易受紅細胞等污染，重復性較差。而PBMCs是感染和病毒復制的主要肝外環(huán)境，同時也是免疫系統對抗感染和適應入侵者的關鍵組成部分。因此，未來研究HBV相關肝癌診斷生物標志物，PBMCs及其miRNA可能是更合適的標本庫。

3.3 獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)

AIDS是危害全球的病毒感染性傳播疾病，由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起，可致機體細胞免疫功能缺陷，引起各種機會性感染及腫瘤。AIDS病死率極高，存活期僅為12～18個月。從初始感染HIV到終末AIDS期是個復雜的過程，期間潛伏期差異大，經歷數月至數年。但目前對于AIDS的診斷還缺乏完善和快速的方法。研究發(fā)現，感染HIV后不同階段的外周血PBMCs miRNA表達譜不同，提示miRNA改變可能是預測HIV感染患者免疫受損程度的生物標志物和藥物治療的靶點。HIV感染患者的PBMCs中的miRNA，如miR-29a和miR-29b也能體現與病毒載量呈負相關作用[30]，與病毒載量高的AIDS患者相比，長期無免疫損害進展的HIV攜帶患者的miR-19b表達上調[31]。此外，研究發(fā)現miR-191-5p在未經治療AIDS患者、接受抗反轉錄病毒治療的AIDS患者、健康對照3個組逐級表達遞減[32]。HIV感染患者的PBMCs和CD8+T細胞中miR-155表達上調，尤其是在未接受治療和治療后未能控制病毒復制的患者中明顯上調，miR-155水平升高與T細胞分化有關[33]。表明此類miRNA可能是HIV感染后免疫反應的潛在生物標志物。

盡管高效抗逆轉錄病毒治療能有效抑制大多數HIV感染者的病毒復制，但有部分患者無法重建免疫功能如CD4+T細胞的數量未恢復或出現免疫效應異常。研究發(fā)現，相比于健康對照組，治療后達到病毒學指標的患者miR-21表達仍上調，T淋巴細胞中miR-21的高表達可抑制免疫激活標志物如CD69、CD25和細胞因子如白細胞介素-2、γ干擾素的表達，從而誘導T細胞過度激活和功能障礙[34]。因此，檢測miR-21水平可能用于評價治療后免疫恢復效果，也為治療HIV的免疫損害提供新的靶點。

3.4 梅毒

梅毒是由梅毒螺旋體感染引起的一種危害全球衛(wèi)生的性傳播疾病，確診需靠病原體檢查，當前的血清學診斷方法缺乏靈敏度和特異度，限制了疾病的早期診斷和治療。梅毒患者經規(guī)范治療后，大多數患者梅毒快速血漿反應素抗體滴度逐漸下降至消失，但部分患者快速血漿反應素滴度持續(xù)陽性，并維持在一個較低水平，稱為血清固定。血清學診斷不能區(qū)分血清固定和潛伏梅毒，因此，識別血清固定狀態(tài)對于梅毒預防具有重要意義。HUANG等[35]首次表明了梅毒感染不同階段PBMCs的miRNA表達有明顯差異，其發(fā)現miR-195-5p在未治療梅毒和血清固定患者中的表達高于血清學治愈和健康對照，miR-223-3p和miR-589-3p在血清固定患者中的表達高于血清學治愈患者。隨后研究發(fā)現Novel-128、Novel-244在未治療梅毒和血清固定患者PBMC中的表達低于健康對照，miR-338-5p在血清固定患者的表達高于健康對照，GO聚類分析結果顯示miR-338-5p靶基因與T細胞受體信號通路、代謝生長密切相關，提示可能在抗梅毒免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，其可能是識別血清固定和潛伏梅毒的生物標志物[36]。而miR-195-5p、Novel-128和Novel-244可能與梅毒螺旋體感染有關，miR-223-3p、miR-589-3p和miR-101-3p可能是診斷梅毒預測治療后血清學反應的潛在生物標志物[37-38]，但也需要進一步的功能性分析驗證。

3.5 寄生蟲感染

寄生蟲感染疾病主要由感染動物和人類并影響公共衛(wèi)生安全的細胞內寄生蟲引起，包括弓形蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲等。對于寄生蟲感染的診斷，病原學診斷方法是首選，也是確診的重要依據。此外，PCR方法也是診斷寄生蟲感染的常用方法，但由于各實驗室采用的檢測方法、應用的試劑標準和技術上的差異，在檢測的結果上也存在一定的差別，從而影響對寄生蟲感染診斷的可靠性。近來研究發(fā)現，寄生蟲感染宿主后miRNA會發(fā)生變化，表明miRNA在寄生蟲-宿主間的調節(jié)作用，尤其是它們在調控寄生蟲生命周期中的作用[4]。miR-146在微生物感染時調節(jié)宿主的免疫系統，如瘧原蟲、利什曼原蟲和弓形蟲感染后表達上調[39]。miR-155在弓形蟲和瘧原蟲攻擊宿主時在單核巨噬細胞、活化的B和T(CD4+)細胞中表達上調[4]。其次，研究發(fā)現弓形蟲感染人類單核-巨噬細胞后，它可通過STAT3與miR-30c-1、miR-125b-2、miR-23b-27b-24-1和miR-17～92基因簇(包括miR-19a、miR-19b和miR-20a)等miRNA基因的啟動子結合，進而介導這些miRNA的上調，抑制感染后單核-巨噬細胞凋亡[40]。此外還有研究表明循環(huán)中miR-712-3p、miR-511-5p、miR-217-5p和miR-9-2在人眼弓形蟲病上調，表明可能具有診斷的意義[41]。利什曼病是由利什曼原蟲感染引起的熱帶性疾病，巨噬細胞是利什曼原蟲在宿主體內復制和逃避抗寄生蟲藥物的主要場所。近來研究發(fā)現其感染后通過調節(jié)人巨噬細胞的miR-21上調，進而調節(jié)轉化生長因子-β信號通路的蛋白質如SMAD7和TRAF6，揭示其可能是利什曼病診斷和感染預后的關鍵生物標志[42]。

3.6 病毒感染

流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，損害呼吸道和肺上皮細胞,患者出現頭痛、發(fā)熱、咳嗽、肺炎等癥狀,嚴重者甚至死亡。甲型流感病毒是流感的主要病原體，引起了4次大流行及每年季節(jié)性流行，危害全球衛(wèi)生健康并導致巨大的經濟損失[43]。甲型流感病毒感染人樹突狀細胞、巨噬細胞和NK細胞并在其中復制，因此，PBMCs基因表達譜分析在甲型流感的臨床診斷和研究中具有廣闊的前景。研究發(fā)現miR-31、miR-29a和miR-148a對甲型流感的危重患者均具有診斷價值，其曲線下面積分別為0.951、0.895和0.881[44]。此外，miR-324-5p、miR-584-5p、miR-1249和miR-3145通過靶向H5N1的編碼病毒RNA聚合酶亞基PB1來抑制H5N1復制[45-46]，可能作為診斷標志物和治療靶點，有助于監(jiān)測高致病性甲型流感的暴發(fā)。

新型冠狀病毒肺炎是一種由嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引發(fā)的傳染病。最近的研究發(fā)現miRNA在新型冠狀病毒肺炎進展中至關重要，與健康人群相比，新型冠狀病毒肺炎患者的PBMCs中miR-16-2-3p、miR-6501-5p、miR-618上調，而miR-183-5p、miR-627-5p、miR-144-3p下調，新型冠狀病毒肺炎患者中miR-6501-5p和miR-618的表達是健康人群的1.5倍。同時，miR-627-5p是下調幅度最大的miRNA，與健康人群相比，變化幅度為2.3倍[47]。新型冠狀病毒肺炎患者中發(fā)現的差異miRNA表達可能調節(jié)病毒感染期間的免疫反應和病毒復制。目前大量的研究致力于SARS-CoV-2感染在人類宿主細胞中的致病性的生物學分子機制，以及探索可能用于該疾病的預測因子和治療靶點的生物標志物。

登革熱是由登革病毒引起的由伊蚊傳播的急性傳染病，登革病毒科分為4種血清型(Ⅰ～Ⅳ)。根據其臨床表現分為典型、輕型和重型登革熱及登革出血熱，部分患者還伴有肺部、肝臟的并發(fā)癥。研究發(fā)現登革熱患者PBMC中miR-4290、miR-1290、miR-33a和let-7e表達上調，miR-106b、miR-20a、miR-30b和miR-3614-5p下調[48]，miR-3614-5p通過靶向登革病毒核心蛋白抑制病毒復制[49]。此外，TAMBYAH等[50]研究發(fā)現14種miRNA在登革熱和流感患者之間出現相似的表達，12種miRNA僅在急性登革熱時發(fā)生特異性改變，可能是登革熱特異性診斷標志物。且miR-24-1-5p、miR-512-5p和miR-4640-3p可有效區(qū)分輕度登革熱患者和伴有并發(fā)癥的重度登革熱患者。隨后也有研究表明，與輕度登革熱患者相比，重度登革熱患者miR-150表達水平進一步升高[51]。此類miRNA可能預測患者并發(fā)癥的發(fā)生，并為減輕重癥患者過激的免疫反應提供了治療靶點。

4 結 語

miRNA可以在不同的組織和細胞類型中廣泛表達，其調控人類基因組中30%的蛋白編碼基因，參與多系統疾病進展。PBMCs中miRNA水平不僅可用作疾病程度分期或分類的工具，還可預測或監(jiān)測治療的臨床反應。然而目前關于同一疾病的各項研究數據還很不一致，常涉及一系列miRNA表達差異，單獨或聯合診斷疾病的準確度比較還需大樣本量研究來確定。多數研究報道的生物標志物具有廣泛的疾病定位，參與多項疾病進程，還有待確定是機體應激結果還是疾病特異的改變。多數研究僅限于生物信息學的分析，還需進一步的功能學研究驗證。未來隨著研究的不斷深入，miRNA有望成為臨床疾病早期診斷、預后預測和治療反應的新型生物標志物，以指導臨床工作。