LOXL2基因與結直腸癌臨床預后及免疫浸潤相關性分析

梁麗金，趙睿學，王 上，李 城△

(1.天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700)

結直腸癌是世界上病死率第四的腫瘤，每年致使近90萬人死亡，而近年來發病率呈上升趨勢，更是給全球公共衛生造成了不小的負擔，目前治療方案包括手術切除、系統治療、局部消融治療、靶向治療和免疫治療等[1-2]。其中，免疫治療在過去的幾十年里一直處于癌癥治療研究的前沿方向，并在結直腸癌領域展現了巨大的潛力。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)家族由LOX和賴氨酸氧化酶樣蛋白(lysyl oxidase-like,LOXL)1～4組成，它不僅在細胞外基質交聯中起關鍵作用，還具有其他與纖維化和癌變相關的細胞內功能[3]，其中LOXL2是該家族目前研究最多的成員之一。LOXL2最初被認為是一種分布在細胞外的分泌蛋白，近年來因其在癌癥進展中的重要作用受到了重點關注。研究表明，LOXL2在多種腫瘤中表達異常，并與腫瘤進展及不良預后有關[4-5]。尤其在結直腸癌中，LOXL2與腫瘤淋巴結轉移和遠處轉移相關，而敲除LOXL2可使腫瘤細胞的增殖和遷移能力降低[6]。探尋新的腫瘤免疫治療方法是目前研究結直腸癌的重要方向，因此，本研究基于生物信息學探討LOXL2在結直腸癌中的表達模式和預后價值，并分析LOXL2與免疫浸潤水平的潛在關系，以期探索免疫治療新靶點和新思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本

本實驗中使用的人結腸癌組織芯片由上海芯超生物科技有限公司提供，組織芯片批號為HColA030PG06。

1.1.2實驗試劑

LOXL2抗體購自英國Abcam公司，兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學染色

組織芯片脫蠟后，按抗體說明修復抗原，進行DAB顯色，蘇木素復染，經乙醇梯度脫水和二甲苯透明后，滴加中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并攝片。

1.2.2Oncomine 數據庫分析

Oncomine數據庫(http://www.oncomine.org)是包含了715個數據集和86 733個標本的大型癌基因芯片數據庫，可利用其分析LOXL2在結直腸癌與正常結直腸組織中的差異表達水平。設置篩選條件如下：P<0.05，表達水平變化>1.5倍，基因表達差異排序為Top 10%。

1.2.3GEPIA數據庫分析

GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)可基于TCGA和GTEx數據快速分析LOXL2在結直腸癌中的表達水平。檢索LOXL2在結直腸癌與正常結腸組織的基因表達譜，條形圖中條形的高度代表LOXL2在結直腸癌或正常結腸組織的中位表達水平。

1.2.4Human Protein Atlas數據庫分析

Human Protein Atlas數據庫(https://www.proteinatlas.org/)提供了多種人類蛋白質的組織和細胞分布信息，檢索LOXL2在人正常結腸組織中免疫組織化學染色結果，分析其表達差異。

1.2.5LOGpc數據庫分析

利用LOGpc數據庫(http://bioinfo.henu.edu.cn/DatabaseList.jsp)分析LOXL2表達水平與結直腸癌患者臨床預后的相關性。進入結直腸癌模塊，選擇GSE40967(n=579)數據集，設置LOXL2對應探針為202998_s_at，以upper 25%為界限劃分高表達組和低表達組，分析總生存期，繪制生存曲線，并對該數據集Ⅰ期(n=37)、Ⅱ期(n=269)、Ⅲ期(n=209)及Ⅳ期(n=60)患者的臨床預后進行分析。

1.2.6TIMER數據庫分析

TIMER數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)可利用高通量測序數據全面、靈活地分析腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況并可視化。本研究通過基因模塊分析LOXL2與結直腸癌免疫浸潤細胞的相關性，并通過相關模塊分析LOXL2與結直腸癌中免疫浸潤細胞標志物基因之間的關系。

1.2.7TISIDB數據庫分析

TISIDB數據庫(http://cis.hku.hk/TISIDB/)記錄了多種與腫瘤免疫相關的基因與高通量篩選等數據，是腫瘤-免疫系統相互作用的綜合信息存儲庫。本研究使用該數據庫的淋巴細胞版塊分析LOXL2與結直腸癌免疫浸潤細胞的相關性。

1.3 統計學處理

采用R4.1.0軟件進行數據分析，計數資料以頻數表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，應用log-rank檢驗生存差異；相關性分析采用Spearman相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LOXL2在結直腸癌中的表達水平

Oncomine數據庫篩選發現，與正常結直腸組織比較，有13項研究顯示LOXL2在結直腸癌組織中呈高表達水平。GEPIA數據庫分析結果顯示，LOXL2在結腸癌(中位表達水平：腫瘤標本=19.98，正常結腸組織=15.01)和直腸癌(中位表達水平：腫瘤標本=23.51，正常直腸組織=16.66)表達上調。LOXL2在正常結腸腺細胞中呈中等強度表達，在結腸腺癌組織中為強陽性表達，見表1、圖1。

表1 LOXL2在不同腫瘤中的差異表達情況(n)

2.2 LOXL2表達水平與結直腸癌患者臨床預后的相關性

LOXL2高表達組的總生存期明顯低于LOXL2低表達組(P<0.05)。LOXL2高表達與Ⅰ期、Ⅳ期患者總生存期無相關性(P>0.05)；與Ⅱ期患者總生存期比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與Ⅲ期患者總生存期比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A：結直腸癌和正常結直腸組織中LOXL2表達水平比較；B：正常結腸組織中LOXL2的表達；C：結腸癌芯片中LOXL2的表達。

A：LOXL2不同表達水平的生存曲線；B：Ⅰ期患者的生存曲線；C：Ⅱ期患者的生存曲線；D：Ⅲ期患者的生存曲線；E：Ⅳ期患者的生存曲線。

2.3 LOXL2與結直腸癌中免疫細胞浸潤水平的關系

LOXL2與結腸癌、直腸癌的腫瘤純度呈負相關(結腸癌:r=—0.336,P<0.001;直腸癌:r=—0.269,P<0.001)。LOXL2與結直腸癌中CD8+T細胞(結腸癌:r=0.194,P<0.001;直腸癌:r=0.345,P<0.001)、樹突狀細胞(結腸癌:r=0.601,P<0.001;直腸癌:r=0.631,P<0.001)、巨噬細胞(結腸癌:r=0.469,P<0.001;直腸癌:r=0.401,P<0.001)和嗜中性粒細胞(結腸癌:r=0.521,P<0.001;直腸癌:r=0.583,P<0.001)的浸潤水平均呈正相關。使用TISIDB數據庫驗證LOXL2與上述4種免疫細胞的關系，LOXL2與激活的樹突狀細胞(結腸癌:r=0.307,P<0.001;直腸癌:r=0.400,P<0.001)和嗜中性粒細胞(結腸癌:r=0.340,P<0.001;直腸癌:r=0.318,P<0.001)的浸潤水平呈正相關，但與巨噬細胞(結腸癌:r=0.527,P<0.001;直腸癌:r=0.466,P<0.001)關系最密切，見圖3。

A：LOXL2與結腸癌中6種免疫細胞浸潤水平的相關性；B：LOXL2與直腸癌中6種免疫細胞浸潤水平的相關性；C：LOXL2與結腸癌中特定類型免疫細胞浸潤水平的相關性；D：LOXL2與直腸癌中特定類型免疫細胞浸潤水平的相關性。

2.4 LOXL2與結直腸癌中巨噬細胞標志物的相關性

結直腸癌中LOXL2與M1型巨噬細胞標志物干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)5、環加氧酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)和信號轉導與轉錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription，STAT)1相關，與M2型巨噬細胞標志物IRF4、Toll-樣受體8 (Toll-like receptors 8，TLR8)相關(P<0.05)，見表2。

表1 LOXL2與結直腸癌中巨噬細胞標志物的關系

續表1 LOXL2與結直腸癌中巨噬細胞標志物的關系

3 討 論

LOXL2對維持細胞外基質結構的完整性和穩定性具有重要的生理意義，并通過細胞外基質在腫瘤進展中起著極其關鍵的影響作用[7-8]。此外，LOXL2還可以調節腫瘤細胞上皮間質轉化過程[9-10]、影響腫瘤血管生成等[11-13]。值得注意的是，LOXL2與腫瘤免疫也有著密切的關系。一方面，隨著機體對腫瘤免疫應答的增強，可觀察到LOXL2表達下調[14]；另一方面，抑制LOXL2不僅可使腫瘤膠原沉積減少，還可提高T細胞浸潤水平[15]，有助于開發新的免疫治療策略。目前LOXL2在結直腸癌領域的相關研究較少，而結直腸癌作為全球重點關注的健康問題，如何早期發現和有效治療一直是研究重點[1]。隨著對結直腸癌病理生理學認識的逐漸深入，科學家們相應提出了不少可供選擇的治療方案。近年來更有研究提出，結直腸癌是腫瘤免疫治療的典范模型[16]。

因此，本研究提出探討LOXL2在結直腸癌中的表達水平及臨床意義，并結合免疫浸潤初步探究其機制。(1)利用多種公共數據庫及免疫組織化學法發現LOXL2在腫瘤組織和正常結直腸組織中的表達存在明顯差異，在結直腸癌中表達上調。在預后價值方面，LOXL2高表達與結直腸癌患者較差的總生存期相關，且或許可用于對處于Ⅱ期～Ⅲ期的患者進行臨床分級，并作為不良預后的分子標志物。(2)用TIMER和TISIDB兩個數據庫分析LOXL2與腫瘤免疫浸潤的關系，發現LOXL2與結直腸癌中樹突狀細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞的浸潤水平相關。其中，本研究結果顯示，LOXL2與巨噬細胞的浸潤水平及其細胞標志物關系最密切。巨噬細胞是慢性炎癥的重要組成部分，參與了包含腫瘤在內的多種人類疾病[17]。巨噬細胞可分為M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞兩大類，M1型巨噬細胞可吞噬腫瘤細胞，而M2型巨噬細胞則可促進腫瘤生長和侵襲。不少研究表明，巨噬細胞分化及表型改變可促進腫瘤進展[18-19]，而浸潤在腫瘤微環境中的巨噬細胞一旦轉變為M2型，即可募集并表達細胞因子和趨化因子，進而成為腫瘤發展的關鍵驅動因素[20]。尤其在結直腸癌中，M2型巨噬細胞數量比M1型多，不僅抑制抗腫瘤免疫[21]，其衍生的外泌體還可誘導結直腸癌細胞侵襲與遷移[22]，提示M2型巨噬細胞和結直腸癌密切相關。基于此，有人提出了靶向巨噬細胞用于腫瘤免疫治療的策略[23]。而本研究發現結直腸癌中LOXL2與巨噬細胞之間存在很強的關系，這不僅進一步證實LOXL2對結直腸癌發生、發展有重要作用，還提示LOXL2可能參與結直腸癌中的巨噬細胞極化。

綜上所述，LOXL2在結直腸癌中的高表達與患者預后不良相關，可作為結直腸癌的預后生物標志物。此外，LOXL2表達可能有助于巨噬細胞等腫瘤免疫浸潤細胞的調節。盡管其具體作用機制還需深入研究，但LOXL2在結直腸癌領域扮演的重要角色是不可忽視的，或許還可作為免疫治療的潛在靶點。