豬回腸炎免疫反應(yīng)及免疫保護(hù)研究進(jìn)展

程蘭玲，李俊輝，張 偉，賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830011）

豬回腸炎 (Porcine proliferative enteropathy，PPE)是由一種重要的革蘭氏陰性胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)引起，以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為主要病理特征的接觸性腸道傳染病，主要引起4～20周齡的生長(zhǎng)育肥豬出現(xiàn)腹瀉、貧血、食欲下降和生長(zhǎng)緩慢等臨床癥狀。潛伏期一般為 2～3周。是在各種養(yǎng)殖條件下均可出現(xiàn)的一種世界性疾病[1]。

1 胞內(nèi)勞森菌的感染研究

1.1 組織毒感染

胞內(nèi)勞森菌是一種胞內(nèi)寄生細(xì)菌，豬感染發(fā)病后影響農(nóng)場(chǎng)的生產(chǎn)力和養(yǎng)殖效益。在野外條件下，細(xì)菌活化的精確分子機(jī)制和PPE發(fā)生所需的環(huán)境條件仍然是未知的。Boutrup等人[2]通過實(shí)驗(yàn)性感染5周齡豬108CFU/mL的組織毒（刮取感染的腸黏膜），研究了早期發(fā)病機(jī)制。研究結(jié)果表明，感染后12 h，細(xì)菌感染小腸上皮細(xì)胞；感染后36 h形成離散灶，感染第5日（5 dpi，days post-infection）， 在重度感染隱窩周圍的固有膜中可以檢測(cè)到細(xì)菌。

1.2 細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)物感染

Macintyre等人[3]用2×108CFU/mL的細(xì)胞內(nèi)純培養(yǎng)物感染7周的仔豬，一半的感染動(dòng)物表現(xiàn)出隱窩上皮增生，在感染第7日的隱窩上皮細(xì)胞之間有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，但是在隱窩固有層沒有明顯的炎癥反應(yīng)。感染第11日，在增生隱窩上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和固有層的單核細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到大量的胞內(nèi)勞森菌。

雖然從感染第5日開始就在黏膜固有層單核細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)菌，但是在感染第11日沒有明顯的炎癥跡象，這表明先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)要么是延遲的，要么是非常溫和的。在感染的早期，胞內(nèi)勞森菌避開了先天性免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的直接作用，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌在小腸腔內(nèi)繁殖，在共生競(jìng)爭(zhēng)中生存，并穿過黏液屏障感染宿主細(xì)胞。

2 不同感染時(shí)期免疫應(yīng)答

2.1 感染后1～14 d，胞內(nèi)勞森菌感染引起的早期黏膜免疫應(yīng)答

豬回腸炎主要有豬小腸腺瘤病（Porcine intestinal adenomatosis,PIA）和增生性出血腸病（Proliferative haemorrhagic enteropathy,PHE）兩種不同的形式。在PIA與PHE兩種形式的回腸中，通過顯微鏡均可觀察到未成熟細(xì)胞增殖、杯狀細(xì)胞缺失和正常的隱窩細(xì)胞分化紊亂等顯微結(jié)構(gòu)改變。PHE形式的回腸中，還有黏膜IgA滴度和細(xì)胞因子的產(chǎn)生延遲，這可能有助于細(xì)菌向固有層的擴(kuò)散[4]。先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)被延遲或非常溫和，可能是由于細(xì)菌的免疫抑制作用。感染胞內(nèi)勞森菌5 d后，在重度感染隱窩周圍的固有膜中檢測(cè)到細(xì)菌；感染11 d后，在增生隱窩上皮細(xì)胞的胞漿和固有層單核細(xì)胞的胞質(zhì)中可見大量的胞內(nèi)勞森菌。在PHE形式的回腸中，急性回腸炎的主要特征是炎癥和黏膜出血，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并分泌炎性細(xì)胞因子進(jìn)入固有層，導(dǎo)致動(dòng)物的特征性癥狀和死亡[5]。

2.2 感染后14～42 d，發(fā)病中期胞內(nèi)勞森菌感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)

感染14～25 d，細(xì)胞內(nèi)感染胞內(nèi)勞森菌的豬小腸腺瘤病形式的黏膜免疫反應(yīng)主要表現(xiàn)為感染高峰期未成熟細(xì)胞過度增殖，杯狀細(xì)胞缺失、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞增加的微觀變化。

感染胞內(nèi)勞森菌后，從5～10 d時(shí)TNFα分泌增加，感染10～20 d時(shí)IFNγ、IL-6分泌增加；第20日時(shí)，抗炎細(xì)胞因子IL-4和TGFβ水平降低，第25日血清中IL-10水平降低[6]。細(xì)胞因子以 IFNγ、TNFα和IL-6分泌增加為主，IL-10，IL-4和TGFβ的血清濃度降低。

盡管IL-10、IL-4和TGFβ濃度降低，但是局部體液免疫反應(yīng)被激活，感染15 d后特異性IgA分泌增加，在感染高峰的末期，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)臂開始啟動(dòng)，感染20 d后血清中分泌TGFβ；感染25 d后分泌IL-8和IL-10。當(dāng)感染第42日時(shí)，感染消退，黏膜固有層CD3+細(xì)胞明顯減少[7]。

到感染第15日，細(xì)菌在小腸和大腸擴(kuò)散，回腸、盲腸、結(jié)腸以及空腸上皮細(xì)胞增生。在此期間，在回腸和空腸固有層、十二指腸、結(jié)腸、盲腸和直腸的隱窩細(xì)胞的管腔和胞漿中，以及近端結(jié)腸黏膜下層的淋巴結(jié)中都檢測(cè)到了細(xì)菌抗原。這些發(fā)現(xiàn)表明，胞內(nèi)勞森菌能夠在不受免疫系統(tǒng)約束的情況下在腸黏膜上傳播。在此期間，細(xì)菌被固有層的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)吸收，并被淋巴組織中的淋巴細(xì)胞提呈，從而引發(fā)抗原特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[8]。感染第19～24天，空腸黏膜組織病理學(xué)增加明顯，到感染第29天，大多數(shù)細(xì)菌從腸上皮細(xì)胞被清除，細(xì)菌抗原主要在固有層的單核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被檢測(cè)到[9]。

從感染第35～42天，在感染消退的腸切片中沒有檢測(cè)到組織學(xué)損傷或胞內(nèi)勞森菌抗原。在感染42 d后，感染消退的特點(diǎn)是固有層CD3+細(xì)胞數(shù)量顯著減少，絨毛中CD8+細(xì)胞明顯減少[8]。此外，MHC-II染色顯示，在感染42 d后，部分固有層的MHC-II+染色總量少。總之，這些數(shù)據(jù)表明適應(yīng)性免疫反應(yīng)至少被延遲到感染后14 d，這可能有助于細(xì)菌的增殖和擴(kuò)散到整個(gè)腸道[5]。

誘導(dǎo)后天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫和體液免疫，分別通過IFNγ分泌細(xì)胞和IgA反應(yīng)的升高來呈現(xiàn)。在感染的后半段，TGFβ和IL-10水平升高，這兩種細(xì)胞因子在抑制過度炎癥、下調(diào)炎癥促進(jìn)因子，以及促進(jìn)腸上皮完整性方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。這些數(shù)據(jù)表明，要想成功地解決胞內(nèi)勞森菌感染，需要充分和及時(shí)地激活炎癥促進(jìn)因子和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，以提供免疫保護(hù)[6]。

3 感染后免疫保護(hù)

3.1 疫苗免疫

目前，有兩種已經(jīng)注冊(cè)的針對(duì)胞內(nèi)勞森菌的疫苗，用于預(yù)防豬場(chǎng)的豬回腸炎疾病。第一個(gè)注冊(cè)疫苗是某某格公司的產(chǎn)品，是一種活的細(xì)菌分離物B3903，在mccoy細(xì)胞中傳20～40代，使其致弱無毒[10]。一項(xiàng)研究結(jié)果表明，與未接種疫苗的對(duì)照組相比，接種腸道疫苗的豬在接受強(qiáng)毒性細(xì)菌攻擊時(shí)，只受到部分保護(hù)，腸道損傷明顯減少，沒有臨床癥狀，日增重也較為明顯。弱毒表現(xiàn)為細(xì)菌細(xì)胞代謝和毒力基因的下調(diào)[11]。

市場(chǎng)上第二種可用于治療胞內(nèi)勞森菌的疫苗是某公司的產(chǎn)品，它是由滅活的全細(xì)胞細(xì)菌與由礦物質(zhì)油和α-生育酚（維生素E）組成的佐劑配制而成。一項(xiàng)研究表明，對(duì)22～25 d斷奶前仔豬免疫接種滅活疫苗，然后用感染性細(xì)菌攻毒[12]，可以顯著提高血清抗體滴度，細(xì)菌排泄物減少15倍，減少了回腸的微小損傷，保持了腸道的完整性。

3.2 疫苗試驗(yàn)療效評(píng)估

Jacobs等[13]通過兩項(xiàng)試驗(yàn)性接種胞內(nèi)勞森菌疫苗，評(píng)估其使用效果，組Ⅰ是在試驗(yàn)性感染條件下，采用皮內(nèi)注射胞內(nèi)勞森菌滅活疫苗與口服市售的胞內(nèi)勞森菌活疫苗的方法，分別單獨(dú)免疫3周齡豬，7周齡攻毒感染，攻毒后2 d觀察結(jié)果；組Ⅱ是在田間條件下，采用PCV混合的胞內(nèi)勞森菌皮內(nèi)注射疫苗的方法免疫81～129日齡豬，24周齡時(shí)感染攻毒，25周齡剖殺，并分別設(shè)置未免疫組作為陰性對(duì)照組。感染攻毒后，通過臨床癥狀、平均日增重、排出物及肉眼與顯微微觀免疫組織的回腸損傷評(píng)分。在田間試驗(yàn)研究中，死亡率與關(guān)鍵性能參數(shù)評(píng)估超過8個(gè)月時(shí)間。研究結(jié)果顯示，胞內(nèi)勞森菌皮下注射疫苗與混合PCV皮下注射免疫疫苗，無論是單獨(dú)免疫還是混合免疫，對(duì)于胞內(nèi)勞森菌的感染都誘導(dǎo)了明顯的保護(hù)作用。與陰性對(duì)照組相比，顯示出了更低的臨床得分及明顯的增重，減少了胞內(nèi)勞森菌的排放及肉眼可觀的回腸損傷。

3.3 疫苗免疫應(yīng)答與效用

Guedes等[14]研究了豬致病性細(xì)胞分離株和商品活疫苗對(duì)豬的免疫應(yīng)答的起始和持續(xù)時(shí)間、細(xì)胞介導(dǎo)和體液免疫反應(yīng)。試驗(yàn)采用4.4×109致病性細(xì)胞分離物的PHE/MN1-00，胞內(nèi)勞森菌致弱活疫苗株接種5周齡豬13周，每組各選1頭于感染22 d后接受安樂死，以確認(rèn)是否感染。接種致病分離株2周后首次檢測(cè)到豬的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)；接種改良活疫苗組的豬分別檢測(cè)到5周和4周的免疫反應(yīng)。接種13周后，仍有部分豬出現(xiàn)體液反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。糞便脫落最初檢出時(shí)間為接種致病菌株1周后，持續(xù)時(shí)間為間歇性12周；接種活疫苗后2周，持續(xù)時(shí)間為間歇性9周。總之，受到致病菌株與活疫苗接種的豬均顯示了長(zhǎng)期的胞內(nèi)勞森菌脫落和免疫反應(yīng)。動(dòng)物接種后1～4周的致病菌分離群中觀察到的持續(xù)性腹瀉與其他試驗(yàn)研究的結(jié)果一致。另外一項(xiàng)研究也證實(shí)了疫苗免疫組沒有明顯的持續(xù)性腹瀉，并證實(shí)了疫苗的安全性[15]。

IFNγ是TH-1型T細(xì)胞介導(dǎo)的重要細(xì)胞因子，可由CD4+或CD8+T細(xì)胞等多種腸黏膜細(xì)胞分泌。趨化因子IL-8還能刺激吞噬細(xì)胞，促進(jìn)血管生成，幫助受損黏膜修復(fù)。多種細(xì)胞因子通過對(duì)抗促炎細(xì)胞因子和維持腸上皮屏障的作用，在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，但這些T細(xì)胞與細(xì)胞因子是如何影響胞內(nèi)勞森菌的仍不清楚[16]。目前，在控制豬回腸炎方面仍然存在諸多挑戰(zhàn)，但是我們可以期待在不久的將來動(dòng)物疾病防治會(huì)找到新方向，使養(yǎng)殖業(yè)獲得新發(fā)展。