紅背葉根水提物對乙醇誘導的酒精性脂肪肝細胞的干預作用及可能機制▲

沈海容 王大東 羅顯克 王保健 吳曉莉 農云翠

(廣西壯族自治區民族醫院消化內科，南寧市 530001，電子郵箱：415487460@qq.com)

陷窩蛋白(caveolin，Cav) 是分子量為21～24 kD的多功能信號蛋白，其家族成員有Cav-1、Cav-2 和Cav-3。研究表明，Cav-1是Cav家族的重要組成部分[1]，是一種高親和力、脂質結合蛋白。Cav-1能被脂多糖、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、氧自由基、轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、瘦素等多種因子激活[2]，與細胞的增殖、凋亡、遷移、炎癥等密切相關[3-5]。研究表明，Cav-1在許多慢性肝臟疾病，如慢性肝炎、肝硬化、肝細胞癌、脂肪肝等肝組織中表達升高[6]。根據組織學酒精性肝病可分為3個階段，即脂肪肝或單純脂肪變性、酒精性肝炎、慢性肝炎合并肝纖維化或肝硬化。我們推斷Cav-1在酒精性肝病中同樣扮演重要角色。本課題組前期研究表明，紅背葉根對酒精性肝纖維化大鼠具有保肝、降酶、抗肝纖維化的作用[7-8]，結合Cav-1在肝臟疾病中所扮演的重要角色，推測Cav-1 可能是紅背葉根防治酒精性脂肪肝的作用靶點之一。本研究通過乙醇誘導建立酒精性脂肪肝離體細胞模型，觀察紅背葉根水提物對乙醇誘導的酒精性脂肪肝細胞中Cav-1表達水平的影響，以初步探討紅背葉根對酒精性脂肪肝的干預作用。

1 材料與方法

1.1 藥物紅背葉根 采自廣東省惠州市，經南方醫科大學中藥鑒定與藥用植物教研室鑒定為大戟科植物紅背山麻桿的根。紅背葉根水提物提取方法：紅背葉根干燥粉碎后，用蒸餾水溶解，4℃、3 000 r/min離心20 min取上清，60℃水浴消毒3次。

1.2 細胞株 人胎肝L02細胞購自中科院上海細胞庫。

1.3 試劑及儀器 高糖杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Gibco公司；小牛血清(56℃、30 min滅活，批號：180127)購自中國浙江天杭生物科技有限公司；谷氨酰胺、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)購自吉諾生物醫藥技術有限公司(批號：18112001)；青-鏈霉素溶液購自吉諾生物醫藥技術有限公司(批號：18106101)。寶特ELx800全自動酶標檢測儀購自美國BioTek公司；Bx60型倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。RNA提取試劑盒TRIzol試劑(批號：18765032)和實時定量PCR試劑盒(批號:741023)均購自日本TAKARA公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養：將復蘇后的L02肝細胞放入培養瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培養液，置于濕度95%、5%CO2、37℃的培養箱中常規培養，每2 d換液1次，每3～4 d用0.25%胰蛋白酶消化，以1 ∶3比例傳代培養。

1.4.2 酒精性脂肪肝細胞模型的建立：將處于對數生長期的細胞消化后，以每孔5×104個細胞接種于96孔板，用含10%小牛血清的DMEM培養液置于5%CO2、37℃的培養箱中飽和濕度條件下常規方法培養4 h，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組和不同濃度乙醇組，不同濃度乙醇組分別在培養液中加入10 μL/孔的20、40、60、80、100 mmol/L乙醇，對照組加等體積培養液。處理20 h后，每孔加入20 μL 5g/L四甲基偶氮唑鹽溶液，繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入DMSO 200 μL，震蕩5 min后，在酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)值。細胞存活率=A給藥組/A對照組×100%。實驗重復6次，每組均設有副孔求取平均值。

1.4.3 紅背葉根水提物對乙醇損傷后L02 細胞存活率的影響：將細胞以每孔5×104個的密度接種于96孔板，分為空白對照組和不同濃度紅背葉根組，不同濃度紅背葉根組給予80 mmol/L乙醇干預24 h后，分別加入不同濃度(12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物，空白對照組只加入等體積的DMEM培養液。干預20 h后，每孔加5 g/L四甲基偶氮唑鹽溶液20 μL。繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加DMSO 200 μL，震蕩5 min后，在酶標儀490 nm處檢測吸光度(A)值。實驗重復6次，每組均設有副孔求取平均值。

1.4.4 紅背葉根水提物對乙醇損傷后L02 細胞三酰甘油水平的影響：按照1.4.3方法分組及處理細胞24 h后，采用不同濃度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物干預紅背葉根組L02 細胞，空白對照組只加入等體積的DMEM培養液，干預20 h后收集細胞，采用細胞三酰甘油檢測試劑盒(上海邦景實業有限公司，批號：19240021)檢測細胞內三酰甘油水平。實驗重復6次，每組均設有副孔求取平均值。

1.4.5 紅背葉根水提物對乙醇損傷后L02 細胞Cav-1 mRNA表達水平的影響：按照1.4.3方法分組及處理細胞24 h后，采用不同濃度(3.125、1.56、0.78、0 mg/mL)紅背葉根水提物干預紅背葉根組L02 細胞，空白對照組只加入等體積的DMEM培養液。干預20 h后收集細胞，采用TRIzol試劑盒提取L02 細胞的總RNA，采用紫外分光光度儀測定A260/A280比值,檢測RNA純度和濃度。采用反轉錄試劑盒(TaKaRa公司，批號：741023)將RNA反轉錄為cDNA，再以β-肌動蛋白作為內參照，用實時定量PCR法檢測L02細胞Cav-1 mRNA的表達水平。所有引物采用Primer Premier 5軟件設計，由武漢華聯科生物技術有限公司合成。Cav-1 mRNA引物上游序列為5′-CGCCATTCTCTCTTTCCTGC-3′，下游序列為 5′-AGACGGTGTGGACGTAGA-3′，β-肌動蛋白引物上游序列5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游序列5′CTGCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反應體系為20 μL，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。反應條件為95℃ ，3 min；95℃，5 s；56℃，10 s；72℃，25 s；39 個循環；65℃，5 s；95℃，50 s。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統分析結果，以Cav-1基因與內參基因灰度值的比值作為Cav-1基因的相對表達水平。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度乙醇對L02 細胞存活率的影響 與對照組比較，不同濃度乙醇組，L02細胞的活性和存活率均下降(均P<0.05)，見表1。乙醇濃度為80 mmol/L時細胞存活率在60%左右，因此本研究使用80 mmol/L的乙醇處理L02細胞建立細胞模型進行后續實驗。

表1 對照組和不同濃度乙醇組LO2細胞活性和存活率的比較

2.2 不同濃度紅背葉根水提物對乙醇損傷L02 細胞存活率的影響 空白對照組、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL紅背葉根組細胞活性和存活率均高于0 mg/mL紅背葉根組，6.25 mg/mL、12.5 mg/mL紅背葉根組細胞活性和存活率均低于0 mg/mL紅背葉根組(均P<0.05)，見表2。本研究選取細胞存活率大于50%的3個紅背葉根濃度組(3.125、1.56、0.78mg/mL)進行后續實驗。

表2 不同濃度紅背葉根對乙醇損傷L02 細胞存活率的影響

2.3 不同濃度紅背葉根對乙醇損傷L02 細胞三酰甘油水平的影響 與空白對照組比較，不同濃度紅背葉根組三酰甘油水平均升高，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組三酰甘油水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度紅背葉根對乙醇損傷L02 細胞三酰甘油水平和Cav-1mRNA相對表達水平的影響(x±s)

2.4 不同濃度紅背葉根對乙醇損傷L02 細胞Cav-1 mRNA相對表達水平的影響 與空白對照組比較，不同濃度紅背葉根組Cav-1 mRNA表達水平均升高(均P<0.05)，且0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組Cav-1 mRNA表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

3 討 論

肝病至今仍是人類沉重的健康負擔和五大死亡原因之一，肝病的發病率及其相關死亡率亦無減輕跡象[9]。作為重要的慢性非傳染性疾病，脂肪性肝病現已取代病毒性肝炎成為全球第一大肝病，對人類健康和社會發展造成嚴重危害[10]。我國是肝病大國，在未來幾年時間里，脂肪性肝病可能將成為我國肝病防治的主要對象，因此，防治脂肪性肝病的緊迫性和必要性日益凸顯[11]。脂肪性肝病按病因可分為酒精性脂肪肝[12]和非酒精性脂肪肝[13-14]。目前用于治療脂肪性肝病的藥物都存在療效不確切、副作用大等缺點。研發高效、價廉、方便、安全的脂肪性肝病治療藥物有重要意義。

在民間紅背葉根用于保肝的歷史悠久，療效確切。本課題組前期研究證實紅背葉根對四氯化碳復合因素及酒精性肝纖維化大鼠均有保肝、降酶、抗肝纖維化的作用[7-8]，并能顯著降低肝纖維化大鼠全血黏度指數，改善循環[15]，同時具有抗病毒作用[16]；另外，紅背葉根還可以通過抑制TNF-α、白細胞介素6、Toll樣受體4等，發揮抗炎、抗氧化應激作用，從而達到防治急性肝損傷的效果[16-22]。本研究結果顯示，一定濃度紅背葉根水提物可以提高乙醇損傷L02細胞的存活率，提示紅背葉根水提物對乙醇損傷的L02細胞有保護作用。

正常肝臟內脂肪含量占5%,當肝內脂肪含量明顯增加,肝細胞內出現大量脂肪顆粒時,稱脂肪肝。各種原因所致的高脂血癥均可伴有肝脂肪浸潤,以三酰甘油增高最為常見[23]。研究表明,三酰甘油主要為肝臟提供能量并為新生細胞膜的形成提供不飽和脂肪酸,三酰甘油的聚集是肝再生過程中的重要因素，Cav-1可通過影響三酰甘油的蓄積來參與脂肪代謝進而影響肝再生過程[24]。因此，本研究通過檢測三酰甘油及Cav-1 mRNA水平來探討紅背葉根水提物對酒精性脂肪肝模型細胞保護作用的機制。本研究結果顯示，不同濃度紅背葉根組三酰甘油及Cav-1 mRNA表達水平均高于空白對照組，但0 mg/mL、0.78 mg/mL、1.56 mg/mL、3.125 mg/mL紅背葉根組三酰甘油、Cav-1 mRNA水平依次降低(P<0.05)。提示紅背葉根水提物可能通過降低三酰甘油及Cav-1 mRNA表達水平而發揮保護酒精性脂肪肝的作用，且具有一定的濃度依賴性，Cav-1 可能是紅背葉根防治酒精性脂肪肝的作用靶點之一。

綜上所述,紅背葉根水提物可能通過降低三酰甘油水平及Cav-1 mRNA表達，發揮對酒精性脂肪肝的防治作用。