α地中海貧血的實驗室分子診斷技術進展

覃柳群 羅世強 嚴提珍

1.柳州市婦幼保健院醫學遺傳科 廣西 柳州 545001

2.柳州市出生缺陷預防與重點實驗室 廣西 柳州 545001

3.柳州市婦幼保健院生殖與遺傳研究所 廣西 柳州 545001

α-地中海貧血（以下簡稱α-地貧）是我國南方地區最常見的單基因遺傳病之一，中國長江以南各省區多見，尤以廣西、廣東和海南三省最為嚴重。廣西和廣東兩省的發病率分別高達14.95%、8.53%[1]。此病主要是由于α珠蛋白基因缺失所引起的典型基因缺失遺傳病，最常見的類型是α-地中海貧血和β地中海貧血，其臨床表現和分型與目的基因的缺失直接相關，臨床暫無有效的治療方法，篩選出合理的實驗室診斷技術對該病的預防具有重要的意義。本文就目前應用于α-地中海貧血的標本種類及多種實驗室分子診斷技術作一綜述。

1 樣本采集、運送及保存

不同的抗凝劑對PCR擴增的影響是不同的，例如肝素抗凝的血液標本經DNA提取后仍會影響PCR的擴增效率。血液的新鮮程度也會影響DNA提取的質量。目前用于地貧檢測的標本極大多數都為EDTA抗凝全血，標本需要保存于4攝氏度冰箱，在運送過程中也需格外注意，不得顛簸、倒放及高熱以防滲漏、溶血等造成交叉污染。駱明勇等[2]發現將150份干血斑標本存放6、9個月后依然能夠穩定地進行地貧基因檢測。該方法為地貧基因檢測提供了一種方便的標本采集方式，特別適用于標本采集困難的檢測對象。另外，現在不少單位已在新生兒中采用干血斑進行血紅蛋白地貧篩查，不用再次采集標本，該方法將在地貧標本轉診網絡建設中發揮重要的作用。

1.1 缺口PCR技術（Gap-PCR）

缺口PCR的原理是進行2對或者3對引物的設計，也就是在缺失區域的外側，在與缺失位點臨近的地方進行1對引物的設計，在缺失區域里面進行1對引物的設計。在正常人和雜合子中處于缺失區域中的引物能擴增片段，同時如果是缺失純合子，則不能擴增。通過缺口PCR方法的應用，可以將三種缺失型地中海貧血準確檢測出來[3]。缺失序列、設計引物兩側翼序列互補，原本正常情況下處在斷裂點兩側翼相距遙遠的引物由于基因缺失突變變得臨近，因而實現一定長度片段的擴增；缺失區域有另外一對引物，當處于雜合子情況或完全正常情況下，才能夠完成正常等位基因的擴增。這一方法依據擴增片段大小能實現正常雜合子、純合子個體的準確區分[4]。

1.2 反向點雜交法（PCR-RDB）

反向點雜交法（PCR-RDB）其原理是將擴增的DNA與固定在尼龍扎帶上的突變特異性探針雜交。PCR擴增產物和探針通過分子雜交反應及顯色反應，觀察檢測膜條上各位點信號的有無，判斷該探針是否與PCR產物雜交，從而確定待檢樣品的基因型[5]。α-地貧分為缺失型和非缺失型，目前主要用PCR結合反向點雜交（RDB）法檢測3種α點突變(αCSα、αQSα、αWSα)[6]。

1.3 多重連接依賴式探針擴增技術（MLPA）

MLPA 是一種多重連接依賴式探針擴增技術。基本原理是把目的基因復制到依賴探針上，再用一對通用引物擴增捕獲到的目的片段，通過對擴增產物進行毛細管電泳分析得出目的片段異常的結果。此技術操作簡單，24小時內可出結果，自動化程度高，有相應的數據分析程序。Liu等[7]應用覆蓋α-珠蛋白基因的MLPA探針對118例標本進行檢測，不僅準確地檢測出單一缺失，如：-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα 等，還可以檢測出復合缺失如-α4.2/--SEA等，特異性和敏感性達100%。郝穎等[8]89對夫婦雙方或一方為α地貧基因攜帶者的家系中的胎兒樣本,同時用Gap-PCR技術和MLPA技術進行檢測α珠蛋白基因的缺失。結果88份胎兒樣本的MLPA檢測結果和Gap-PCR檢測結果完全一致；1份胎兒樣本（絨毛組織）經Gap-PCR檢測未能確診，后結合MLPA檢測確診為-SEA/αα。

1.4 多色探針熒光PCR熔解曲線法

多色探針熒光PCR熔解曲線法，主要利用改良分子探針對PCR產物進行實時分析的突變檢測技術。分別計算出各個樣本、校準品的 ΔCt 值（目的基因減去參比基因的Ct值差），再將待測樣本的ΔCt減去正常對照樣本△Ct得ΔΔCt 計算 2-ΔΔCt即可得到待測樣本，相對于校準品目的基因的相對拷貝數。這種目的基因相對定量模式，無需制備標準曲線，可靈敏地檢測出基因拷貝數的差異。嚴提珍等[9]采用 PCR-熒光探針法對303例臨床樣本進行α珠蛋白基因拷貝數定量檢測，檢測結果與 Gap-PC R法結果比較分析，結果表明兩種方法結果完全一致的有 301例，不吻合的有2例，符合率為 99.34%。這2例經MLPA技術復核，發現檢測結果與Gap-PC R法結果一致，且該方法整個檢測過程都在封閉的PCR管中進行，PCR和熔解分析僅需一個程序完成，與目前的RDB法和測序法相比，具有明顯的高通量和操作簡便的優勢，同時又大大降低了PCR擴增產物污染的機會。

1.5 基因芯片技術

基因芯片雜交法是在PCR擴增的基礎上，應用熒光標記法將大量的寡核苷酸片段或 DNA片段有序排列在固相載體上，稱之為基因芯片或DNA陣列，同時提取待檢測樣品DNA，與芯片雜交，然后掃描芯片的熒光強度，應用生物信息學分析結果，最后得到樣品中基因序列和表達水平或突變的相關信息。該技術能快速、準確地從分子水平診斷疾病。王沙燕等[10]和黃培堅[11]都利用基因芯片技術進行α-地貧基因檢測，他們認為基因芯片法具有快速、高效、自動化程度高且簡便等優點，但由于該技術所需設備和耗材昂貴，限制其在臨床推廣應用。

1.6 DNA測序

DNA測序技術能夠直接準確的對基因突變的位置和性質進行判斷，是檢測未知地中海貧血基因突變的金標準。Sanger法是最常用的第一代測序技術，該技術為定性實驗，不能對大片段的基因缺失進行檢測，且費時費力費用高，隨著DNA測序技術的進步，出現了高通量測序技術，又稱下一代測序技術，它一次能并行對數以百萬條DNA分子進行序列測定，對所有類型的地中血進行檢測。譚梅等[12]用高通量測序技術在206例受檢新生兒中篩查出地中海貧血基因突變的有22例，其中 α-地中海貧血11例，β-地中海貧血11例，新發5例。宋春林等[13]用高通量測序對1368例樣本中一共檢出了523例（38.2%），共25種地中海貧血基因突變，常規基因檢測陰性而高通量測序陽性結果經Sanger測序結果一致。他們認為高通量測序在地貧檢測上值得推廣。但是DNA序列測定法操作繁瑣，所需儀器設備昂貴，極大地限制了其在臨床診斷中的應用。

2 總結

目前地貧基因診斷主要采用EDTA抗凝靜脈全血，采血量大，不利于對新生兒的采集；采血管的轉運也存在低溫轉運不便及容易破管等許多問題。干血斑是通過采集適量的血液，足跟血、末梢血均可，滴在濾紙片上并干燥而成，具有需要標本量少、便于運輸,保存等優點，非常適合血液標本采集和轉運.

實驗室診斷的總標準是成本低、效率高和方便簡單，同時需保證疾病診斷準確性，避免出現漏診和誤診現象。實驗室分子診斷技術中各自有自身優劣勢，因此，充分了解每種技術的應用范圍及局限性,結合各自實驗室的具體情況，尋找到準確、高效、經濟的診斷方案，對于各高發地區預防中重型地中海貧血患兒的出生及提高 新生人口素質具有積極且深遠的意義。