植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

王詩憶，黃奕孜，李舟陽，黃華宏，林二培

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

植物體細(xì)胞胚胎(體胚)發(fā)生是指已分化的體細(xì)胞不經(jīng)過性細(xì)胞融合，經(jīng)歷類似合子胚發(fā)育的途徑直接形成植株的過程[1]，是除合子胚發(fā)育途徑之外另一種獲得完整植株的重要手段，也是植物細(xì)胞全能性的一種體現(xiàn)。自首次在胡蘿卜Daucus carota中發(fā)現(xiàn)體胚發(fā)生現(xiàn)象以來，人們在大量不同植物的組織培養(yǎng)、單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的過程中都觀察到或?qū)崿F(xiàn)了體胚發(fā)生[2?3]。因具有相對的遺傳穩(wěn)定性、可重復(fù)性和高效性等優(yōu)點(diǎn)，體胚發(fā)生已經(jīng)成為了重要的生物技術(shù)工具，在種質(zhì)資源保存、優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)、人工種子、分子及細(xì)胞工程育種和基礎(chǔ)研究等方面都有著廣泛的應(yīng)用。

植物體胚發(fā)生是一個涉及生長素、細(xì)胞分裂素等激素信號和復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的過程。近年來的研究表明：一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子是體胚發(fā)生的主要介導(dǎo)者，其在生長素和細(xì)胞分裂素等激素信號刺激下啟動和調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而啟動體胎發(fā)生，調(diào)控體胚發(fā)育[2]。此外，基因組的表觀修飾也被認(rèn)為是影響植物體胚發(fā)生的重要因素，DNA甲基化、組蛋白去乙?；缺碛^修飾都是植物體胚發(fā)生調(diào)控途徑的重要組成部分[4?6]。隨著研究的深入，一些體胚發(fā)生的關(guān)鍵基因(如Baby Boom、Wuschel等)也被用于提高體胚發(fā)生的頻率和轉(zhuǎn)基因效率，已在玉米Zea mays等較難轉(zhuǎn)化的植物中獲得了成功[7?8]。本研究將對體胚發(fā)生的途徑、體胚發(fā)生關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制、表觀遺傳修飾對體胚發(fā)生的調(diào)控及體胚發(fā)生關(guān)鍵基因的利用等進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)的研究和技術(shù)開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 植物體胚發(fā)生的途徑

體胚發(fā)生的過程極其復(fù)雜，從體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變是體胚發(fā)生的前提，也是其中最關(guān)鍵的一步。這個過程需經(jīng)過脫分化，激活細(xì)胞分裂周期和重新組織生理、代謝與基因表達(dá)等多個步驟。外植體經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生體胚的途徑主要有2種，即間接體胚發(fā)生和直接體胚發(fā)生。

間接體胚發(fā)生是最常見的途徑，即在離體條件下細(xì)胞經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)再分化形成體細(xì)胞胚。間接體胚發(fā)生需要經(jīng)過3個階段：第1階段是愈傷組織的形成，愈傷組織是一種看似無組織的原始空泡細(xì)胞團(tuán)，由活的薄壁細(xì)胞組成，表現(xiàn)不同程度的緊實(shí)度和致密性；第2階段是愈傷組織的胚性化，胚性的愈傷組織由周細(xì)胞和非周細(xì)胞共同發(fā)育而來[9?10]，其質(zhì)地一般較為堅實(shí)，顏色呈乳白色或黃色，表面具球形顆粒，由直徑細(xì)胞組成，細(xì)胞較小，無液泡，且常富含淀粉粒；第3階段是體細(xì)胞胚的形成，胚性愈傷組織形成之后，在愈傷組織的表面或內(nèi)部產(chǎn)生原胚團(tuán)，單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)再從中發(fā)育成胚[11]。在以幼胚、胚或子葉為外植體時，通常可以直接誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生體細(xì)胞胚。因此，就經(jīng)過愈傷組織的間接體胚發(fā)生而言，胚性愈傷組織的形成是體胚發(fā)生的關(guān)鍵。

直接體胚發(fā)生，即從培養(yǎng)中的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，不經(jīng)過愈傷組織階段。這種途徑中，外植體增殖較少，且致密細(xì)胞分裂更規(guī)則[2]。單個或多個細(xì)胞層中的單個或多個細(xì)胞無須進(jìn)一步處理即可分裂并膨大，形成形態(tài)可識別的胚胎[1]。直接體胚發(fā)生主要可分為2個階段：第1階段為誘導(dǎo)期，在此階段，細(xì)胞進(jìn)入分裂狀態(tài)；第2階段為胚胎發(fā)育期，前一階段形成的瘤狀物繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)過球形胚、心形胚等發(fā)育過程，最終形成體細(xì)胞胚。下胚軸、子葉、莖表皮等外植體體細(xì)胞脫分化后，由表皮細(xì)胞或亞表皮細(xì)胞經(jīng)過不等分裂，產(chǎn)生1個胚細(xì)胞和1個胚柄細(xì)胞，后者發(fā)育類似胚柄，前者進(jìn)一步分裂，由原胚發(fā)育為成熟胚。

直接途徑和間接途徑產(chǎn)生的體胚在形態(tài)學(xué)上相似，但由于間接途徑的組織培養(yǎng)時間較長，產(chǎn)生的體胚更容易發(fā)生基因組水平上的變化(體細(xì)胞變異)[12]。體胚也可以用來誘導(dǎo)新一輪的胚胎發(fā)生，稱為次生或重復(fù)體胚發(fā)生[13]。次生胚可以直接從原胚誘導(dǎo)，也可以在胚性愈傷組織形成后間接誘導(dǎo)。另外，體胚發(fā)生經(jīng)歷直接途徑或間接途徑往往取決于外植體的年齡：外植體離合子胚胎階段越遠(yuǎn)，就需要越多的重編程過程將外植體重新轉(zhuǎn)化為體胚[14]。盡管從發(fā)育成熟或較老的組織和器官中誘導(dǎo)獲得體胚通常比較困難，但無論組織的年齡如何，它們都可以通過直接途徑或間接途徑產(chǎn)生體胚[9,15]。因此，在確定體胚發(fā)生是通過直接途徑還是間接途徑時，細(xì)胞或組織與培養(yǎng)環(huán)境相結(jié)合的發(fā)育背景會比其距離胚胎階段的時間更為重要。

2 植物體胚發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制

2.1 Somatic Embryogenesis Receptor Kinase (SERK)

SERK基因是在研究胡蘿卜體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中被發(fā)現(xiàn)的。SCHMIDT等[16]從胡蘿卜下胚軸懸浮培養(yǎng)的胚性細(xì)胞中分離出了第1個SERK基因(即DcSERK)，其只在胚性細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且只表達(dá)到體胚發(fā)育的球形期，而在非胚性細(xì)胞及球形期后的體胚中均不表達(dá)。隨后在許多其他植物的研究中也鑒定到了不同的SERK同源基因，如椰子Cocos nucifera (CnSERK)、柑橘Citrus reticulata (CrSERK1)、鴨茅Dactylis glomerata (DgSERK)、蒺藜苜蓿Medicago truncatula (MtSERK)、水稻Oryza sativa (OsSERK)、小麥Triticum aestivum (TaSERK)和葡萄Vitis vinifera (VvSERK)等[17]。在擬南芥Arabidopsis thaliana中過量表達(dá)SERK基因，能使體細(xì)胞胚胎發(fā)生的能力增加3～4倍，表明它能夠促進(jìn)植物體胚的發(fā)生[18]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)SERK在細(xì)胞表面過表達(dá)時，可以通過識別分子信號介導(dǎo)其蛋白LRR區(qū)與胞外蛋白結(jié)合，這種結(jié)合能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部的信號級聯(lián)放大(如油菜素甾醇信號通路)[19]。這些信號可以識別不同的靶點(diǎn)，并通過染色質(zhì)重塑增強(qiáng)體胚發(fā)生早期基因的表達(dá)(例如Leafy Cotyledon和Baby Boom)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞或組織向胚胎發(fā)生轉(zhuǎn)變[18?19]。因此，SERK可能是體胚發(fā)生過程中促使體細(xì)胞向胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。

2.2 Leafy Cotyledon (LEC)

LEC屬于nuclear factor Y(NF-Y)轉(zhuǎn)錄因子家族，也是涉及許多功能的B3結(jié)構(gòu)域蛋白大家族的成員，諸如LEC1、LEC2和FUSCA3(FUS3)等LEC基因都被認(rèn)為是調(diào)節(jié)植物胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子[20]。LEC基因(LEC1和LEC2)最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，lec突變體具有胚胎發(fā)育不正常、缺少胚胎特異性蛋白、胚胎提早萌發(fā)等特征，表明LEC基因?qū)τ诰S持植物胚胎特性具有重要的功能[21?22]。與其他調(diào)控因子只在胚胎發(fā)育特定階段起作用不同，LEC基因在早期的胚胎形態(tài)發(fā)生階段及后期的胚胎成熟階段都起著重要的作用。在胚胎發(fā)育早期，LEC基因決定胚柄細(xì)胞命運(yùn)，控制子葉特性，對維持體胚發(fā)生和促進(jìn)球形胚的產(chǎn)生也具有重要作用；而在后期的胚胎成熟階段，LEC基因的表達(dá)與種子成熟過程相關(guān)，包括儲藏物質(zhì)的積累和胚抗脫水性的獲得等[23]。

研究發(fā)現(xiàn)：LEC2基因的過表達(dá)會表現(xiàn)出異常發(fā)育的現(xiàn)象，如異位愈傷組織的產(chǎn)生等，但無法進(jìn)一步分化為體胚[24]，這表明LEC2基因可能提供了實(shí)現(xiàn)體胚發(fā)生所需的條件，但僅在體胚發(fā)生的誘導(dǎo)階段起著重要作用[25?26]。而LEC1基因在轉(zhuǎn)基因植物中的異位表達(dá)會誘導(dǎo)體細(xì)胞胚樣結(jié)構(gòu)的形成[27]，并在擬南芥體胚發(fā)生的整個過程中表現(xiàn)出差異表達(dá)模式。這表明LEC1基因可能參與了體胚的分化和發(fā)育，而不是體胚的誘導(dǎo)[28]。FUS3和LEC2有43%的同源性，均為VP1/ABI3-like B3家族轉(zhuǎn)錄因子[29]。FUS3基因在頂端分生組織中的特異表達(dá)，可以促使轉(zhuǎn)基因植物頂端分生組織產(chǎn)生體胚[30]。

2.3 Baby Boom(BBM)

BBM是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族AINTEGUMENTA-LIKE(AIL)進(jìn)化枝的成員。最初是在利用甘藍(lán)型油菜Brassica napus未成熟花粉誘導(dǎo)單倍體胚胎時，發(fā)現(xiàn)的1個花粉體胚發(fā)生調(diào)節(jié)基因(BnBBM)，在甘藍(lán)型油菜和擬南芥中異位表達(dá)時可誘導(dǎo)體胚的發(fā)生，該基因被認(rèn)為在體胚發(fā)生過程中能促進(jìn)細(xì)胞分裂和形態(tài)發(fā)生[31]。后續(xù)研究表明：BBM基因是植物細(xì)胞全能性的關(guān)鍵調(diào)控因子，在沒有外源植物生長調(diào)節(jié)劑或脅迫的情況下也能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的形成[8]。比如BnBBM的異位表達(dá)可以在無需施加植物生長調(diào)節(jié)劑的條件下誘導(dǎo)擬南芥幼苗葉片和子葉上的體胚發(fā)生[31]。利用BnBBM基因還可促進(jìn)毛白楊Populus tomentosa愈傷組織形成體胚[32]，而在再生困難的辣椒Capsicum annuum中異源表達(dá)BnBBM基因能有效克服辣椒遺傳轉(zhuǎn)化過程中再生及轉(zhuǎn)化困難的瓶頸問題[33]。BBM基因過表達(dá)還可以誘導(dǎo)其他類型的再生，包括愈傷組織、不定芽和根的形成，它的這種特性已被用于改善作物和模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率[32,34?35]。

2.4 Wuschel (WUS)

WUS基因編碼1個同源盒轉(zhuǎn)錄因子，它具有1個高度保守的同源盒結(jié)構(gòu)域和保守的C末端區(qū)(包含3個功能性結(jié)構(gòu)域：1個酸性結(jié)構(gòu)域、1個WUS-box和1個EAR-like元件)[36]。WUS基因的1個重要特征是它具有可移動性，它會從其生物合成的位置(干細(xì)胞龕中央?yún)^(qū))移動到周邊區(qū)的子細(xì)胞中，并在周邊區(qū)激活1個負(fù)調(diào)控因子CLAVATA3(CVL3)的轉(zhuǎn)錄[37]。CLV3移動到胞外與CLV1結(jié)合，反過來抑制WUS的轉(zhuǎn)錄，這種WUS-CLV反饋系統(tǒng)維持了干細(xì)胞庫的穩(wěn)定和頂端分生組織的發(fā)育[38?39]。因此，WUS基因被認(rèn)為是體胚發(fā)生和芽再生過程中所必需的[39?40]。

與LEC2類似，WUS基因會對生長素作出響應(yīng)，生長素能促發(fā)1個調(diào)控營養(yǎng)組織向胚性組織轉(zhuǎn)變的信號級聯(lián)途徑，而這種轉(zhuǎn)變是受WUS基因調(diào)控的[41]。大量研究表明：在蒺藜苜蓿、陸地棉Gossypium hirsutum和中粒咖啡Coffea canephora等不同植物體胚發(fā)生過程中，WUS同源基因的表達(dá)都會明顯上調(diào)[42?45]。WUS基因在擬南芥中的過表達(dá)可以誘導(dǎo)體胚發(fā)生以及芽和根尖的器官發(fā)生[46]。擬南芥WUS基因經(jīng)過雌二醇誘導(dǎo)，在中粒咖啡中異源表達(dá)，能夠誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，并促進(jìn)中粒咖啡體胚的循環(huán)發(fā)生[42]，而在陸地棉中則可通過啟動生長素運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高胚性愈傷組織的分化效率[45]。

2.5 體胚發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

近年來，大量的染色質(zhì)免疫共沉淀和基因表達(dá)研究表明：植物體胚發(fā)生存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(尤其是生長素途徑)，不同的轉(zhuǎn)錄因子之間存在轉(zhuǎn)錄交互(cross-talk)調(diào)控[2]。

BRAYBROOK等[47]以過表達(dá)LEC2的擬南芥幼苗為材料，利用基因芯片分析確定了LEC2的靶基因，其中包括生長素途徑基因和AGAMOUS-LIKE 15(AGL15)轉(zhuǎn)錄因子。LEC2能夠激活生長素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS 1 (TAA1)以及YUCCA2和YUCCA4(YUC)的表達(dá)。而LEC2過量表達(dá)可以補(bǔ)償不足量2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或效率較低的生長素[如吲哚乙酸(IAA)或萘乙酸(NAA)]在體胚誘導(dǎo)中的作用[48]。反之，在正常的2,4-D含量下，LEC2的異位過表達(dá)不利于體胚的發(fā)生，往往會產(chǎn)生愈傷組織而非體胚[26,48]。LEC2與AGL15間存在轉(zhuǎn)錄交互調(diào)控作用，即LEC2能夠上調(diào)AGL15的表達(dá)，AGL15也可以上調(diào)LEC2的表達(dá)。AGL15的過量表達(dá)會促進(jìn)未成熟胚的體胚形成，但不會誘導(dǎo)種子苗自發(fā)的體胚發(fā)生，這表明AGL15只是增強(qiáng)了胚性組織的體胚發(fā)生能力[49]。值得注意的是，LEC2和AGL15均能激活I(lǐng)NDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 30 (IAA30)的表達(dá)，該基因編碼一種非典型的Aux/IAA蛋白質(zhì)，且AGL15促進(jìn)的體胚發(fā)生在iaa30突變體中明顯受到削弱[47,50]。這暗示LEC2和AGL15可能共同通過生長素途徑調(diào)控體胚發(fā)生，但目前AGL15和IAA30在LEC2誘導(dǎo)的體胚發(fā)生中作用尚不明確。

通過染色質(zhì)免疫沉淀，在經(jīng)2,4-D和BBM誘導(dǎo)的體胚中都鑒定出了BBM的下游靶基因，發(fā)現(xiàn)BBM能夠結(jié)合LAFL (LEC1-ABI3-FUS3-LEC2)和AGL15基因的啟動子區(qū)域[2]。在lec1和fus3突變體中，BBM不能誘導(dǎo)體胚的發(fā)生，而在lec2和agl15突變體中，BBM誘導(dǎo)的體胚明顯減少，說明BBM調(diào)控的LAFL/AGL15表達(dá)是BBM途徑關(guān)鍵的下游路徑[2]。反過來BBM的表達(dá)也受到LAFL蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)：BBM的表達(dá)量在lafl突變體種子中降低，說明LAFL轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)節(jié)BBM的表達(dá)[2]。這些發(fā)現(xiàn)表明：BBM和LAFL基因間也存在轉(zhuǎn)錄交互調(diào)控作用，是生長素信號通路的一部分。

WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION1(WIND1)是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的另一成員，其過表達(dá)也能誘導(dǎo)體胚發(fā)生[51]。WIND1及其同源基因WIND2～4由傷口誘導(dǎo)，并在組織損傷后刺激愈傷組織增殖[52]。與BBM/LAFL蛋白不同，WUS和WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION1 (WIND1)蛋白通過細(xì)胞分裂素信號通路調(diào)控體胚發(fā)生。WUS通過抑制A型ARR基因來控制莖分生組織的生長，該基因是細(xì)胞分裂素應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子[53]，而WIND1通過B型ARR基因刺激愈傷組織的形成，該基因是細(xì)胞分裂素應(yīng)答的正調(diào)節(jié)因子。WUS和WIND1也與LEC途徑相互作用。比起單獨(dú)激活WIND1或LEC2，按順序激活WIND1和LEC2在外植體中能誘導(dǎo)更多的胚性愈傷組織[54]。WIND1的過表達(dá)增加了外植體中胚性細(xì)胞的數(shù)量，這些細(xì)胞對LEC2作出響應(yīng)后就形成體胚[54]。反之，WUS被誘導(dǎo)表達(dá)后會降低其誘導(dǎo)的體胚組織中LEC1的表達(dá)水平，這表明WUS抑制了LEC途徑[41]。綜上所述，在植物體胚發(fā)生過程中，LEC、BBM和WUS等重要的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成了1個復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

3 體胚發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳調(diào)控也是植物體胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。近年來，DNA甲基化、組蛋白去乙?；?甲基化等重要的表觀遺傳機(jī)制均已被證實(shí)可以控制植物體胚發(fā)生的過程[55?56]。

3.1 DNA 甲基化

DNA甲基化是涉及生物學(xué)過程的重要表觀遺傳機(jī)制，它是表觀基因組調(diào)節(jié)和維持基因表達(dá)程序的關(guān)鍵因素[57]。DNA甲基化對體胚發(fā)育具有重要作用。通常，非胚性組織的基因組甲基化水平更高，而胚性組織的基因組甲基化水平則較低[58?60]。在白橡Quercus alba中，體胚誘導(dǎo)時基因組DNA會被去甲基化，但隨著胚胎發(fā)育，甲基化水平逐漸提高[61]。在進(jìn)行中?？Х润w胚誘導(dǎo)時，原胚組織的DNA甲基化水平較低，而隨著體胚的成熟，甲基化水平逐漸升高[62]。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)：DNA甲基化及其維持對體胚發(fā)生的調(diào)控是必需的[63]，類似的結(jié)果在挪威云杉Picea abies中也有發(fā)現(xiàn)[64]。

DNA甲基化也可通過引起特定基因的沉默，從而在體胚發(fā)生中發(fā)揮重要作用。如LEC1基因的啟動子區(qū)域在體胚發(fā)生開始之前發(fā)生低甲基化，隨后在胚胎成熟及營養(yǎng)生長期中甲基化水平增加；利用RNA導(dǎo)向的DNA甲基化對LEC1基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行超甲基化會下調(diào)其轉(zhuǎn)錄，表明LEC1基因的轉(zhuǎn)錄受其啟動子的甲基化調(diào)節(jié)[65]。此外，還發(fā)現(xiàn)甲基化抑制劑5-azacitidine的應(yīng)用可抑制或阻斷胡蘿卜培養(yǎng)物中的體細(xì)胞胚發(fā)生[66]，而藥物5-aza-2′脫氧胞苷可以通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶1的活性來促進(jìn)體胚發(fā)生，并且它還增加了體胚發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子STM的轉(zhuǎn)錄。這些證據(jù)表明：基因組DNA的甲基化水平和特定基因區(qū)域的DNA甲基化修飾與體胚發(fā)生有直接的聯(lián)系。

3.2 組蛋白甲基化

組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶完成的。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶在決定細(xì)胞命運(yùn)中的重要性首先在動物上得到了證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)Polycomb抑制復(fù)合體2 (PRC2)成員進(jìn)行組蛋白H3K27me3標(biāo)記，是干細(xì)胞多能性所必需的[67]。在擬南芥中，PRC2基因CURLY LEAF (CLF)和SWINGER (SWN)或VERNALIZATION 2 (VRN2)和EMBRYONIC FLOWER 2 (EMF2)雙突變體在莖尖上形成愈傷組織，最終會引起間接的體胚發(fā)生和異位根[68]。CLF還抑制成熟胚胎中的大量基因，包括AGL15、FUS3、ABI3、AIL5和AIL6/PLT3等與體胚發(fā)生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[69]。IKEUCHI等[70]也發(fā)現(xiàn)：PRC2突變體的根毛無法維持其已分化的狀態(tài)，反而會形成無組織的細(xì)胞團(tuán)，并且最終通過愈傷組織形成體胚，其部分原因是由于PRC2基因的突變導(dǎo)致其靶基因WIND3和LEC2的表達(dá)抑制被解除，進(jìn)而誘導(dǎo)根毛細(xì)胞脫分化。這些研究說明：PRC2通過組蛋白甲基化抑制相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞分化的過程，反之則會引起細(xì)胞的脫分化，進(jìn)而誘導(dǎo)體胚的發(fā)生。

3.3 組蛋白去乙?；?/h3>

組蛋白H3和H4的乙酰化對基因表達(dá)有正向的調(diào)控作用，組蛋白乙酰化的水平和位置受到組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)的嚴(yán)格控制。組蛋白去乙酰化也是與體胚發(fā)生密切相關(guān)的表觀遺傳修飾。TANAKA等[71]提供了組蛋白去乙酰化在體胚發(fā)生過程中起主要作用的第1個證據(jù)。他們研究表明：HDAC抑制劑曲古抑菌素A(TSA)能使擬南芥種子苗的萌發(fā)生長停滯，并誘導(dǎo)胚胎標(biāo)記基因LEC1、FUS3和ABI3的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致胚胎不能完成向幼苗生長的過渡。類似現(xiàn)象在2個HDACs-hda6/hda19雙突變體中也可以觀察到，且該雙突變體能在擬南芥葉片上產(chǎn)生體胚結(jié)構(gòu)[71]。后續(xù)的研究進(jìn)一步揭示了這2個HDACs抑制胚胎基因表達(dá)的機(jī)制。其中，HDA19會特異性地結(jié)合VAL2[72]，HDA6則特異性結(jié)合VAL1[73]，VAL1和VAL2又會與轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體(mediator complex)的抑制性亞基CDK8結(jié)合，進(jìn)而招募這2個HDACs和抑制形態(tài)的轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合體抑制LAFL基因的表達(dá)[73]。

組蛋白去乙酰化促進(jìn)體胚發(fā)生的作用在其他植物的體胚誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中也獲得了證實(shí)。萌動的云杉Picea asperata體胚經(jīng)TSA處理后會維持其體胚的狀態(tài)，而不會轉(zhuǎn)化為幼苗[74]。在小麥中，TSA和丁酸鈉(另一種HDACs抑制劑)的處理可以增加胚性愈傷的誘導(dǎo)率和芽的分化率，但TSA有廣譜的效果，丁酸鈉對不同基因型的效果有差異[6,75]。TSA處理還可顯著提高熱脅迫后的甘藍(lán)型油菜小孢子單倍體體胚發(fā)生的效率，表明熱激處理和組蛋白去乙酰化可能共同作用于體胚發(fā)生調(diào)控因子的上游，從而啟動體胚發(fā)生的程序[76]。與H3K27me3類似，組蛋白乙酰化水平和HDACs的活性在激素誘導(dǎo)的間接體胚發(fā)生中會發(fā)生變化[77?78]，暗示在間接體胚發(fā)生的早期階段，組蛋白去乙?；饔每赡軈⑴c了體細(xì)胞的重編程。這些研究表明：在植物中組蛋白去乙?；钦{(diào)控體胚發(fā)生的保守途徑。

4 關(guān)鍵基因在體胚發(fā)生和遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

目前，植物的高效遺傳轉(zhuǎn)化仍然是一個巨大挑戰(zhàn)，其主要原因是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞往往難以發(fā)育成完整的植株。雖然，通過組培方法、農(nóng)桿菌侵染等條件的優(yōu)化，水稻、擬南芥、楊樹Populus等少數(shù)植物的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了成功，但仍存在基因型依賴嚴(yán)重、轉(zhuǎn)化效率低等問題。隨著體胚發(fā)生機(jī)制研究的深入，一些關(guān)鍵的體胚發(fā)生調(diào)控基因被逐漸用于提高植物遺傳轉(zhuǎn)化和再生的效率[79]。

BBM和WUS是2個最常用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的體胚發(fā)生關(guān)鍵基因。例如，甜椒Capsicum frutescens是具有重要營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值的蔬菜，但也是公認(rèn)的難以轉(zhuǎn)化的頑拗材料。HEIDMANN等[35]研究發(fā)現(xiàn)：在甜椒中瞬時表達(dá)BnBBM基因可以高效地誘導(dǎo)細(xì)胞再生，并產(chǎn)生大量可發(fā)育成植株的體胚，認(rèn)為利用該基因可以為難轉(zhuǎn)化的植物開發(fā)一種有效的遺傳轉(zhuǎn)化和再生的體系。在玉米中，ZmBBM和ZmWUS2基因共轉(zhuǎn)化未成熟胚時，轉(zhuǎn)基因愈傷的比例顯著提升，且在多個難轉(zhuǎn)化的玉米近交系中均有明顯效果[80]。此外，ZmBBM和ZmWUS2的共轉(zhuǎn)化還可以在高粱Sorghum bicolor、甘蔗Saccharum officinarum和水稻中提高轉(zhuǎn)化效率[80]。因此，BBM和WUS被認(rèn)為是單子葉作物基因工程中具有重要潛在利用價值的關(guān)鍵基因[79]。而在雙子葉植物中，MAHER等[81]將WUS2和ipt或WUS2和STM共轉(zhuǎn)化煙草Nicotiana tabacum無菌種子苗，在煙草葉片上實(shí)現(xiàn)了芽的原位誘導(dǎo)，避免了繁瑣的組培過程；且利用該策略，成功地對PDS基因進(jìn)行了基因編輯，獲得了基因編輯的后代。針對栽培的煙草植株，MAHER等[81]通過注射攜帶WUS2和ipt或WUS2和STM基因的農(nóng)桿菌在傷口處直接誘導(dǎo)了芽的形成，并且也可以實(shí)現(xiàn)對PDS基因的編輯獲得后代。該方法在番茄Solanum lycopersicum、葡萄中也獲得了成功試驗(yàn)，證明了WUS等基因在雙子葉植物基因工程中的應(yīng)用潛力。

5 總結(jié)與展望

體胚發(fā)生是體現(xiàn)植物細(xì)胞全能性的一種重要形式，一直是植物學(xué)研究的熱點(diǎn)。對于植物體胚發(fā)生的研究，從最初的激素含量和組合方式等誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，到在多種植物中鑒定和表征了許多參與體胚發(fā)生的基因，并通過操縱關(guān)鍵基因的表達(dá)來啟動及調(diào)控體胚的發(fā)生發(fā)育，再到全面研究體胚發(fā)生的通路和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，觀察再生過程中的動態(tài)表觀遺傳變化，標(biāo)志著對體胚發(fā)生規(guī)律的認(rèn)識一直在不斷深入和完善。

細(xì)胞和分子生物學(xué)的進(jìn)步以及各種新技術(shù)的出現(xiàn)，為進(jìn)一步研究植物體胚發(fā)生過程涉及的更深層次細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制提供了條件和機(jī)遇。深入探究體胚發(fā)生過程中激素信號與基因表達(dá)之間，以及調(diào)控基因間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，解析體胚發(fā)生的分子機(jī)制及信號途徑，將為闡明體胚發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律提供更多的證據(jù)。表觀遺傳修飾在體胚發(fā)生調(diào)控中的重要性已得到證實(shí)，但表觀遺傳修飾如何參與體胚發(fā)生，在體胚發(fā)生過程中如何維持和建立DNA甲基化，以及基因不同區(qū)域的甲基化如何參與植物體胚發(fā)生中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等問題仍沒有答案，需深入的研究來解開表觀遺傳修飾調(diào)控體胚發(fā)生的謎團(tuán)。

此外，將關(guān)鍵基因的表達(dá)與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來，在更多的植物中實(shí)現(xiàn)體胚發(fā)生，進(jìn)而提高植物的再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化的效率，可為更多植物實(shí)現(xiàn)基因編輯等高效和精細(xì)的遺傳操作提供新的途徑，這對加快優(yōu)良品種的繁育和分子育種平臺的建立，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)都具有十分重要的意義。