血清HBV RNA在抗病毒治療中的應用進展*

張 琪 綜述，秦 波 審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院感染科 400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個全球性健康問題。據世界衛生組織(WHO)報道，全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病和并發癥，尤其是肝硬化和原發性肝癌[1]。目前用于治療乙型肝炎的抗病毒藥物主要包括兩大類：核苷類似物(nucleoside analogues,NAs)和干擾素(interferon,IFN)。隨著它們的廣泛應用，HBV的復制得到了有效抑制，肝硬化和肝癌的發生也得到了改善。

肝內共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的持續存在是導致HBV感染慢性化的主要原因。肝內cccDNA的清除意味著慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)完全治愈[2]。NAs或IFN均無法直接作用于肝內cccDNA，因而完全治愈幾乎無法實現。目前多以臨床治愈作為CHB治療的理想終點，即治療后乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA，HBV DNA)持續消失、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)轉陰、伴或不伴HBsAg血清學轉換，而無論肝內cccDNA是否被清除[1-3]。肝內cccDNA的存在使得達到臨床治愈的患者仍面臨停藥后復發的風險，因而大多數CHB患者需長期甚至終生服藥。

理論上，監測肝內cccDNA水平對評估CHB患者病情及評估抗病毒治療療效均有幫助。臨床工作中由于肝穿刺難以推廣，肝內cccDNA的監測困難重重，亟待尋找可以反映肝內cccDNA存在及活性的新指標。血清HBV RNA就是近年的研究熱點之一。其作為一種新型血清學標志物[4]，已被證明是包含前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)及其剪切變異體的病毒樣顆粒或衣殼抗體復合物。而pgRNA由肝內cccDNA直接轉錄形成，因此，血清HBV RNA在一定程度上也可以反映肝內cccDNA存在與活性，且在反映抗病毒治療應答及預測停藥后復發等方面也具有重要意義。本文將對血清HBV RNA的來源及性質，血清HBV RNA與肝內cccDNA的關系，以及血清HBV RNA在抗病毒治療中可能的作用進行綜述。

1 血清HBV RNA的來源及性質

HBV是有包膜的DNA病毒，其基因組為部分雙鏈環狀DNA(relaxed-cirular DNA,rcDNA)。HBV通過與肝細胞膜上的鈉離子-牛磺膽酸-協同轉運蛋白結合進入肝細胞。進入肝細胞后，rcDNA在細胞核內以負鏈DNA為模板形成cccDNA，接著以cccDNA為模板轉錄形成3.5×103、2.4×103、2.1×103、0.7×103這4種不同長度的mRNA。其中長3.5×103的pgRNA作為模板，在聚合酶作用下逆轉錄形成rcDNA，同時募集乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)形成核衣殼。這些含有病毒基因組的核衣殼一方面可以獲得病毒包膜后形成完整的病毒顆粒，另一方面也可以直接進入肝細胞核作為肝內cccDNA儲備。

自1996年在慢性HBV感染者血清內發現HBV RNA以來，血清HBV RNA的來源一直受到廣泛關注。最近WANG等[5]證實血清HBV RNA實際上是由未經轉錄或部分轉錄的pgRNA經衣殼化、被HBsAg包裹所形成的病毒樣顆粒。JANSEN等[6]通過使用去污劑破壞HBsAg包膜，并利用HBcAg特異性抗體行免疫沉淀，進一步證明了血清HBV RNA與病毒樣顆粒的關聯：即血清HBV RNA存在于含有衣殼和包膜的病毒樣顆粒中。隨后，PRAKASH等[7]也通過梯度分離和核糖核酸酶實驗表明，血清中的HBV RNA存在于病毒樣顆粒中，其結構類似于含有包膜、攜帶HBV DNA的傳染性單顆粒。同時，該研究還發現血清HBV RNA是多聚腺苷酸化的，具有基因組長度。BAI等[8]實驗則發現血清HBV RNA主要由pgRNA或被聚合酶水解形成的pgRNA剪切變異體組成，在長度上具有異質性，從3.5×103到數百個核苷酸不等；主要以衣殼-抗體復合物形式循環，少部分以病毒樣顆粒形式循環。而針對這些病毒樣顆粒的研究顯示，NAs治療下血清中的HBV RNA病毒樣顆粒缺乏傳染性，其中3′-末端截短體的形成可能是造成這些病毒樣顆粒復制缺陷的主要原因[9]。

因此，血清HBV RNA實際上是包含pgRNA及其剪切變異體的病毒樣顆粒或衣殼抗體復合物，目前的研究顯示在NAs治療時這些病毒樣顆粒不具有傳染性，而在未接受NAs治療的患者中，HBV RNA病毒樣顆粒是否具有感染能力仍需進一步研究加以證實。

2 血清HBV RNA與肝內cccDNA的關系

前述已提及pgRNA由肝內cccDNA直接轉錄而來，因而血清HBV RNA在一定程度上可以反映肝內cccDNA存在與活性。GIERSCH等[10]研究發現未經治療的HBeAg陽性的HBV感染小鼠的血清HBV RNA與肝內cccDNA水平相關(r=0.89,P<0.001)。WANG等[5]使用恩替卡韋/拉米夫定阻斷體外細胞和轉基因小鼠HBV DNA聚合酶的逆轉錄活性后，發現pgRNA病毒樣顆粒水平上升，提示NAs僅阻斷rcDNA生成而不影響pgRNA合成,因而提出NAs治療下血清HBV RNA水平仍可反映肝內cccDNA存在及轉錄活性。

GAO等[11]關于HBeAg陽性CHB患者的一項隊列研究顯示基線肝內cccDNA水平和血清HBV RNA水平相關(r=0.25，P=0.02)，但較HBsAg與肝內cccDNA相關性低(r=0.36，P<0.01)。NAs治療后，肝內cccDNA下降水平與血清HBV RNA下降水平相關(r=0.28，P<0.05)，但低于與HBsAg(r=0.38,P<0.01)和HBV DNA(r=0.35,P<0.01)下降的相關性。CHEN等[12]研究認為與HBV RNA和HBsAg相比，乙型肝炎病毒核心抗原相關抗原(hepatitis B virus core antigen associated antigen,HBcrAg)與cccDNA有更好的相關性。研究共納入未接受過抗病毒治療的85例HBeAg陽性者和25例HBeAg陰性者，經多變量線性回歸分析發現在HBeAg陽性者，血清HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均與肝內cccDNA相關，其中血清HBcrAg(β=0.563，P<0.001)與cccDNA的相關性優于血清HBsAg(β=0.328，P<0.001)和HBV RNA(β=0.180，P=0.003)。在HBeAg陰性者，只有血清HBcrAg與肝內cccDNA水平相關(β=0.774，P<0.001)。上述研究均表明血清HBV RNA與肝內cccDNA相關性較好，但其并不是用于反映肝內cccDNA的單一優勢指標。

血清HBV DNA聯合HBV RNA在反映肝內cccDNA活性方面顯示出優越性。HUANG等[13]研究發現CHB患者的血清HBV DNA聯合HBV RNA對于反映肝內cccDNA水平(r=0.412，P<0.001)優于單用HBV RNA(r=0.363，P<0.001)或HBV DNA(r=0.367，P<0.001)。進一步分層分析顯示，這一現象僅在HBeAg陽性者中存在，提示血清HBV RNA聯合HBV DNA在反映HBeAg陽性者肝內cccDNA活性方面具有優勢。

因此，血清HBV RNA在一定程度上可反映肝內cccDNA存在及活性，但或許不是反映肝內cccDNA的最優指標。如果能將血清HBV RNA和HBV DNA或HBcrAg、HBsAg等指標結合在一起，肝內cccDNA水平或許能更可靠、更準確地被反映出來，但血清HBV RNA具體該如何與其他指標聯用仍需要進一步研究。

3 血清HBV RNA在抗病毒治療中的應用

3.1 血清HBV RNA可反映抗病毒治療應答

多種研究表明基線血清HBV RNA可預測抗病毒治療應答。LUO等[14]經過回歸分析發現血清HBV RNA是預測HBeAg血清轉化和病毒學應答的獨立指標。基線血清HBV RNA<4.12 log10拷貝/毫升的患者更易實現HBeAg血清學轉換(靈敏度和特異度均為80%)。JANSEN等[6]一項研究包括86例接受聚乙二醇干擾素(pegylated interferon,Peg-IFN)和NAs聯合治療的患者，該研究顯示低基線血清HBV RNA水平可以預測HBeAg陰性患者聯合治療應答效果(OR=0.44，P=0.19)。

除基線血清HBV RNA水平外，抗病毒治療過程中血清HBV RNA水平及其變化也能預測抗病毒治療應答情況。VAN CAMPENHOUT等[15]對76例接受Peg-IFN單獨治療、55例接受Peg-IFN聯合拉米夫定治療的患者進行研究，發現治療第12、24周的血清HBV RNA水平顯示出預測HBeAg血清轉化的良好能力(受試者工作特征曲線下面積>0.75，P<0.001)。治療第12周血清HBV RNA>5.5 log10拷貝/毫升可協助早期辨別30%的治療無應答者(陰性預測值>90%)。GAO等[11]則發現NAs治療96周后，實現HBeAg陰轉的患者血清HBV RNA水平明顯更低(P<0.01)，而在基線、治療后第48、72周時兩組血清HBV RNA水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。筆者研究后認為兩個研究在時間上顯示出的差異性或許與NAs及IFN抗病毒機制不同有關：NAs主要通過抑制逆轉錄過程實現抗病毒作用，而IFN則同時具有免疫調節及抗病毒作用，因而IFN較NAs更能有效地抑制HBV復制、耗竭肝內cccDNA儲備，從而使血清HBV RNA水平更早下降，幫助更早預測HBeAg血清學轉換。

血清HBV RNA聯合其他血清學指標較其單一使用時能更好地預測抗病毒治療應答。LIAO等[16]對16例長期接受NAs治療、血清HBV DNA持續低于檢測下限的HBeAg陽性CHB患者進行研究，發現9例發生了HBeAg轉陰的患者其血清HBV RNA及HBcrAg水平下降更為明顯(P<0.05)。表明對于接受NAs治療且實現病毒學應答的患者，血清HBV RNA和HBcrAg有助于監測抗病毒治療效果。WANG等[17]研究發現HBeAg陽性者經恩替卡韋治療后，第24周時的血清HBV RNA水平是HBeAg血清轉化的有力預測因子，但血清HBV RNA聯合HBeAg預測HBeAg血清轉化優于單用血清HBV RNA。

因此，基線及抗病毒治療后血清HBV RNA及其變化在反映抗病毒治療應答方面顯示出一定優勢。但血清HBV RNA聯合HBcrAg或HBeAg等指標可能將進一步優化抗病毒治療效果評價體系。未來以血清HBV RNA為基礎的抗病毒治療應答評價體系的具體應用需要更多的實驗加以驗證。

3.2 血清HBV RNA可預測停藥后復發

血清HBV RNA能反映停藥時肝內cccDNA狀態，因而在預測停藥后復發方面具有重要作用。WANG等[5]對33例接受NAs治療后達停藥標準的CHB患者進行停藥后隨訪，發現停藥時血清HBV RNA陽性的21例患者全部出現復發，停藥時血清HBV RNA陰性的12例患者僅3例發生復發(100%vs.25%,P=0.001)，提示停藥時血清HBV RNA水平是監測NAs治療安全停藥的潛在指標。另一項研究對32例接受Peg-IFN單獨治療或與NAs聯合治療后，實現HBsAg陰轉、HBV DNA低于檢測下限的CHB患者進行研究[18]。停藥后隨訪發現，治療結束時血清HBV RNA陽性的所有7例患者在停藥后均出現HBsAg逆轉、HBV DNA復陽，而HBV RNA陰性的25例患者中僅5例出現HBsAg逆轉、HBV DNA復陽。該研究表明這些看起來實現了“功能治愈”的CHB患者，其HBV復制模板(尤其是停藥時血清HBV RNA呈陽性的患者)——cccDNA，可能仍然具有轉錄活性，停藥后仍面臨較大的復發風險。SETO等[19]的研究發現停藥時血清HBV RNA≥44.6 U/mL的患者停藥后發生病毒學復發的風險更高(48周累積發生率為93.2%)，提示停藥時血清HBV RNA≥44.6 U/mL的患者不應輕易中斷NAs治療。

血清HBV RNA聯合其他血清學指標可預測停藥后持續應答，用于指導安全停藥。FAN等[20]納入130例治療前HBeAg陽性、接受替比夫定或阿德福韋治療并達到停藥標準的CHB患者，發現停藥時實現血清HBV RNA和HBV DNA雙陰性的患者臨床復發比例(8.0%)明顯低于停藥時未達雙陰性的患者(31.4%，P=0.018)，該結論在40例接受恩替卡韋或替諾福韋治療的HBeAg陽性患者中同樣適用。提示治療結束時血清HBV RNA和HBV DNA雙陰性與HBeAg陽性患者停止治療后的持續應答相關聯。FAN等[21]另一項研究對127例基于替比夫定治療的HBeAg陽性患者進行停藥后隨訪，發現在治療結束時血清HBV RNA和HBcrAg均為陰性者未出現臨床復發，而治療結束時血清HBV RNA和HBcrAg均為陽性者有46.8%在隨訪期間出現臨床復發(P<0.001)，該結論在59例使用恩替卡韋或替諾福韋治療的患者同樣適用，提示血清HBV RNA聯合HBcrAg可用于指導NAs治療后安全停藥。CAREY等[22]研究則表明對于在NAs治療下、HBV DNA持續檢測不到的患者，血清HBV RNA和HBcrAg仍然是反映HBeAg陰性者肝內cccDNA持續轉錄的靈敏血清學指標，兩者同時也是預測停藥后谷氨酸氨基轉移酶升高及病毒學復發的重要指標。

因此，停藥時血清HBV RNA水平可預測停藥后復發，協助指導安全停藥。相比而言，停藥時血清HBV RNA陽性者在停藥后面臨更大的復發風險，因而不應輕易停止抗病毒治療。此外，停藥時血清HBV RNA聯合HBV DNA或HBcrAg預測雙陰性患者停藥將更為安全，其在臨床實踐中的應用需要進一步研究。

3.3 血清HBV RNA相關的新型抗病毒藥物

由于血清HBV RNA在CHB患者抗病毒治療過程中的重要作用，近年來針對阻斷血清HBV RNA生成的衣殼裝配調節劑(capsid assembly regulators,CAMs)也受到了一定關注。CAMs大致可分為兩大類[23]，一類是以NVR 3-1983為代表的苯丙烯酰胺和氨磺酰苯甲酰胺化學物，另一類是以BAY 4109為代表的雜芳基二氫嘧啶類化合物。前者可促進衣殼類似物的形成，后者則誘導和聚集異常衣殼結構。CAMs可以引導衣殼進行錯誤組裝，導致pgRNA的包裹受到抑制，進而阻止了pgRNA病毒樣顆粒(即血清HBV RNA)的產生；另外CAMs還可以抑制HBV DNA復制，導致丹顆粒的形成受到抑制。由于肝內cccDNA來源于pgRNA逆轉錄形成的松弛環狀DNA(rcDNA)，因而通過CAMs抑制pgRNA的生成或許會幫助耗竭肝內cccDNA儲備，向完全治愈更近一步。雖然目前暫無相關上市藥物，但CAMs藥物的研究將為眾多的CHB患者帶來更多的希望。

4 總結與展望

血清HBV RNA不僅可反映抗病毒治療應答，還能預測停藥后復發，其與HBV DNA、HBcrAg、HBsAg等指標聯合使用時更具優勢。目前已有學者提出基于血清HBV RNA的一些新概念，如將病毒學應答重新定義為血清HBV DNA和HBV RNA的持續丟失[24]；提出“準臨床治愈”概念，即血清HBV DNA、HBV RNA持續丟失伴血清HBsAg低水平[24]；將隱匿性肝炎(occult hepatitis,OBI)重新定義為在HBsAg檢測不到的個體血清或肝臟中,HBV DNA和(或)HBV RNA持續陽性[18]。而筆者認為，未來血清HBV RNA在臨床中具體該如何應用仍需進一步大規模、前瞻性、系統性研究。此外，血清HBV RNA水平與慢性HBV感染的時期[25-26]、HBeAg狀態、谷氨酸氨基轉移酶水平、基礎核心啟動子突變和HBV基因型均相關[15]。因此，血清HBV RNA作為臨床標記物的使用，還必須考慮這些因素，相信未來阻斷血清HBV RNA合成的多靶點藥物將會為乙肝治愈提供新的可能。