淋巴系統再生醫學與組織工程的研究進展

杜奉舟 龍笑

【提要】 各種原因導致的淋巴系統損害仍然是臨床亟待解決的難題。再生醫學和組織工程技術的發展為淋巴系統修復開辟了重要的途徑。近年來，對淋巴系統生理的理解逐漸深入，淋巴系統再生醫學展現出許多新的重要進展，包括細胞因子的應用、支架系統的開發、細胞療法、組織工程淋巴系統的構建等。本文將對淋巴系統再生醫學、組織工程的現狀及其最新進展進行綜述。

淋巴系統在維持內環境穩態中發揮著不可替代的作用。淋巴水腫是淋巴系統因各種原因受到破壞以后，組織間液回流受阻，進而引起組織腫脹，繼發慢性炎癥，嚴重影響患者的生存質量。目前，針對淋巴水腫最常用的治療方法是物理治療，通過非手術方法促進組織間液回流[1]。這些療法不但需要長期規律地維持，而且無法重建損傷的淋巴管系統。手術治療，包括建立淋巴管旁路、淋巴管－靜脈吻合、血管化淋巴結移植等，有可能重建淋巴回流通路。隨著顯微外科技術的發展，淋巴管吻合的成功率得以提高[2]。但手術可能導致供區損傷，甚至引發供區淋巴水腫。

組織工程與再生醫學研究的高速發展，包括組織工程淋巴回流系統、生長因子的遞送、細胞治療、基因編輯等再生醫學領域的最新成果，均為淋巴管重建提供了新的途徑。本文將綜述近年來再生醫學在淋巴水腫中的最新進展。

1 淋巴系統的發生和生理

淋巴系統起源于靜脈，在胚胎期的第1 到7 周由前主靜脈出芽形成[3-4]。淋巴管相關基因的表達，如PROX-1、LYVE-1、VEGFR3 等，對于淋巴管結構的分化和形成起到了關鍵作用[5]，同時也成為鑒別與分離淋巴內皮細胞的標記之一。淋巴系統的起始由一側盲端膨大的淋巴毛細管廣泛分布、吻合組成。作為淋巴系統營養吸收的基本單元，毛細淋巴管由單層淋巴內皮細胞組成，借助微絲與胞外基質相連接固定，相較毛細血管缺少平滑肌、內皮細胞、周細胞及連續的基底膜覆蓋[4]。淋巴集合管從毛細淋巴管叢延伸匯集而來，具有相對完整的基底膜和平滑肌覆蓋。淋巴集合管還具有方向瓣膜，在淋巴管平滑肌及相應部位骨骼肌收縮時，避免由于淋巴液匯集導致的反流[6]。淋巴集合管會進一步合成淋巴干及淋巴導管。淋巴系統在溝通血管和調節循環體液平衡方面有著重要作用。病理條件導致的淋巴管障礙、淋巴液潴留、胞外基質重塑及脂質沉積等，均會影響淋巴管的功能及再生，引起淋巴性水腫[7-8]。

2 促進淋巴管再生的生長因子及其應用

血管內皮生長因子（VEGF）C 和D 及其受體VEGFR-3介導了調節淋巴管再生的主要信號通路[4]，并在一系列體內/外試驗中得到效果驗證。在先天淋巴管缺乏導致的淋巴水腫耳模型中，真皮層注射VEGF-C 表達的腺病毒可有效促進淋巴管的出芽和生長[9]。此外，通過重組蛋白、轉染病毒載體及質粒等方法補充VEGF-C 蛋白表達，可在兔、小鼠、大鼠、羊等多種動物模型中促進皮瓣切口淋巴組織再生[10]，提高淋巴結移植治療淋巴水腫的效果[11-12]。除VEGF-C 外，其余血管生長因子，包括FGF（誘導淋巴管生成）、HGF（獨立于VEGF 機制外的促淋巴管增殖）、IGF（刺激淋巴內皮細胞增殖及遷徙）、PDGF、EphB4（調控淋巴管的重塑及瓣膜形成）等，在淋巴管再生方面的報道較少，需要進一步的研究證實。

除了對于促進淋巴管修復效應因子的研究外，對于抗淋巴管再生的機制探究，也是該領域的關鍵問題。在某些病理條件下，淋巴管功能障礙并不伴淋巴管相關效應因子表達異常，提示存在其他機制直接或間接地介導了淋巴管再生障礙過程。在鼠尾淋巴水腫模型中，內源性及依賴細胞的VEGFC 因子過表達，不足以促進足夠的淋巴系統再生，而同一模型中加入對TGF-β 的局部或系統抑制，可顯著促進淋巴管修復[13]，符合既往TGF-β 抑制淋巴內皮細胞增殖、遷移及淋巴管形成的相關報道[14]。上述研究表明，淋巴管再生是由促修復機制與抑制修復機制的平衡決定的。VEGF-C 也被報道了不良反應，包括對于腫瘤治療引起的繼發淋巴管損傷，在修復淋巴水腫的同時可能促進腫瘤新生血管形成，以及由于新生淋巴管結構功能不良導致淋巴性水腫的加重等[15]。因此，在特定情況下，抑制抗淋巴管修復的機制可能是一種更好的選擇。近期的報道指出，相關分子，包括IFN-γ、內皮素等，均在鼠尾水腫模型中顯示出類似TGF-β 的抗淋巴管再生作用。這些研究展示了通過影響淋巴管再生軸調控促淋巴系統修復的可能性。

3 淋巴組織再生中的細胞療法

3.1 淋巴內皮細胞（Lymphatic endothelial cells，LECs）

淋巴內皮細胞是淋巴毛細管網的主要組成部分。因此，在淋巴管再生中，LECs 被視為增加細胞數量最直接的方法[16]。以裸大鼠構建的鼠尾淋巴水腫模型中，注射人LECs 可顯著減少腫脹體積，改善大鼠尾部的淋巴毛細血管生長[17]。此外，注射36 d 后在新淋巴毛細血管中檢測到了人源細胞，這表明外源性LECs 可以直接參與原位淋巴管生成。LECs 也被用來預構淋巴－血管化組織，有研究證明在體內移植后，組織整合過程得到了加速。雖然治療有效，但自體LECs 來源有限，而且獲得細胞需要侵入性的外科手術。內皮集落形成細胞（Endothelial colony forming cells，ECFCs）可作為LECs 的一種替代。ECFCs 主要來源于外周血和組織中分離出來血管內皮，可在體外大量擴增[18]。最重要的是，有一組ECFCs 可以表達淋巴特異性轉錄因子，包括Prox-1、LYVE-1、VEGFR-3 和podoplanin[19]。這些細胞可以形成脈管系統，或直接參與體內新生淋巴管[20]。在免疫缺陷小鼠皮下注射ECFCs，細胞整合進入新形成的毛細淋巴管，并促進了血管和淋巴毛細血管生長[21]。

3.2 誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）

由于iPSCs 可以大量產生各種患者特異性細胞，iPSCs是幾乎所有類型細胞的潛在來源[22]。iPSCs 可以分化為LECs譜系，并在體外和體內參與形成淋巴毛細血管。當與LECs 共培養時，在新形成的毛細淋巴管中可見iPSC-LECs。體內研究還表明，在裸鼠皮膚傷口愈合模型中注射iPSC-LECs 時，能夠通過淋巴管生成和淋巴血管生成來增強傷口愈合。此外，iPSC-LECs 可以減少小鼠尾部淋巴水腫模型中的鼠尾腫脹，這證實了在臨床治療淋巴水腫的應用潛力[23]。值得注意的是，畸胎瘤風險仍然是iPSCs 來源細胞的主要關注點。在iPSC-LEC 的臨床應用之前，需要更嚴格的實驗設計和全面檢查。

3.3 間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs 由于其獨特和優越的性質，包括旁分泌效應[24]和免疫調節性質，已被廣泛應用于組織工程[25]。MSCs 在損傷部位分泌淋巴管生成因子，如VEGF、HGF、PDGF 和bFGF，可以刺激淋巴管生成[26]。在大鼠后肢及鼠尾模型中，注射脂肪來源間充質細胞可觀察到淋巴水腫的緩解、淋巴管的修復等[27-28]。此外，ASC 與淋巴管內皮細胞體外共培養可表現出外周VEGF濃度升高，密集淋巴網絡形成等協同作用[29]。這些研究提示了基于可大量獲取的脂肪來源干細胞誘導淋巴系統修復，緩解淋巴水腫的可行性，并初步提供了體內試驗證據。將兔MSCs懸浮液注射到兔肢體淋巴水腫部位，術后28 d 觀察到肢體腫脹改善，淋巴管數量增加[30]。目前，hMSCs 懸浮液注射已被用于治療淋巴水腫的臨床試驗中[31]。據報道，乳腺癌相關淋巴水腫患者腋窩區域注射hMSCs，在6 個月后半數患者的保守治療減少，且沒有嚴重不良反應。hMSCs 的治療效果主要歸因于其旁分泌效應，通過分泌淋巴管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、HEG、FGF 和ANG 等，來刺激淋巴管生成。此外，hMSCs 可以向LECs 樣細胞分化，表明MSCs 還直接參與構建新淋巴管系統。盡管MSCs 在治療淋巴水腫方面顯示出巨大的潛力，但其免疫調節和分化特性可能因供體差異而不同。因此，制定系統性策略（如預處理方法等）以增加hMSCs 的穩定性、效力和免疫調節特性，對于改善其臨床結果至關重要。

4 淋巴系統再生的支架

三維環境為LECs 生長和形成網狀結構提供了框架。因此，由天然或合成聚合物和水組成的水凝膠通常用于組織工程研究。這些水凝膠可以容納細胞和生物活性物質，同時可以改變其機械性能。為了找到淋巴毛細血管生長的理想水凝膠，Helm 等[32]使用了不同量的膠原蛋白和纖維蛋白原，每種膠原蛋白和纖維蛋白原都具有共價結合的VEGF-121。他們發現，只有纖維基質可以提供合適的環境，能夠在共聚焦顯微鏡下評估毛細淋巴管的形成。然而，在另一項研究中，LECs與成纖維細胞共培養，膠原-Ⅰ基質中毛細淋巴管的密度略高于纖維基質，但并不顯著[33]。

Matrigel 也被用于研究LECs 網絡，但是通過添加VEGF-C 和/或ADSCs 不能誘 導管形成[34]。Matrigel 是從 小鼠Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤細胞中獲得的一種液體基底膜基質，含有多種生長因子。Dai 等[35]設計了基于聚乙醇酸支架的血管內皮細胞移植系統，并在體內試驗中進一步探究其對于淋巴管網絡形成的作用。與傳統方法所用的膠陣不同，該系統保留了支架的硬度和可塑性，更便于術中操作，并且具有良好的生物相容性和降解能力。

多面體硅氧烷寡聚物聚氨酯（POSS-PCU），是一種用于重建氣管、淚管、耳和心臟瓣膜的納米材料。Kanapathy 等[36]將該材料作為支架用于構建組織工程集化合淋巴管，并以人真皮來源的LECs 作為支架內襯。支架在拉伸強度、縫合線保持力和抗扭結性方面表現出良好的機械性能，但其毛細管作用低，且不含任何瓣膜。雖然LECs 黏附良好，但最終并未形成內皮襯里，并且POSS-PCU 上內皮細胞的代謝活性、細胞密度顯著低于對照組（玻璃表面）。Wong 等[37]研究了無細胞真皮基質作為生物支架介導的淋巴管內生，證實在無細胞真皮層，血管及淋巴管內皮可迅速再生，形成典型真皮脈管系統結構，且無細胞支架產生了更少的炎癥刺激，為無細胞基質作為生物支架，提供脈管系統內生所需結構及刺激因子提供了可行性。

Biobridge 是一種由納米纖維膠原組成并提供空間結構的支架。Hadamitz 等[38]在豬后肢淋巴水腫模型中探究了Biobridge 在淋巴管生成中的效果。實驗分為Biobridge 加淋巴結，Biobridge 加VEGF-C 及對照3 組進行，加入Biobridge 的組顯示出更高的移植后支架周圍淋巴管密度（100 μm 對比2 000 μm）。另外，CT 及電阻率測定顯示，僅Biobridge 加淋巴結組產生了具有功能的淋巴管系統。最新的一項臨床前研究顯示，在大鼠后肢淋巴水腫模型中，淋巴結切除時就植入Biobridge，可有效避免淋巴水腫的產生，而對于已經產生淋巴水腫的大鼠，移植Biobridge 和脂肪間充質干細胞可減輕淋巴水腫[39]。

5 組織工程化淋巴系統

隨著對淋巴系統發生機制和淋巴組織結構認識的深入，體外構建組織工程化淋巴系統成為可能。組織工程化淋巴系統移植可加速損傷組織的功能恢復。目前組織工程淋巴系統研究包括組織工程化毛細淋巴管，淋巴結和集合淋巴管。

5.1 組織工程化毛細淋巴管

體外制備的組織工程化毛細淋巴管比直接使用細胞懸液更有利于加速淋巴系統的修復。研究表明，組織工程化毛細淋巴管移植后可自動與原有淋巴管形成吻合。通過在水凝膠纖維中共培養LECs，內皮細胞和成纖維細胞，可制備出含毛細血管和淋巴管的人皮膚移植物[33]。移植至裸鼠后可觀察到移植物中淋巴管與裸鼠的淋巴管網吻合，并可形成淋巴引流。類似的研究還有，采用LECs，內皮細胞，與脂肪來源的基質細胞在纖維支架中共培養，構建形成管網結構[40]。

值得注意的是，近年來無支架的細胞膜片組織工程技術開始興起。細胞膜片技術不使用胰蛋白酶消化細胞，從而保存了完整的細胞膜片結構，確保細胞間以及細胞和細胞基質之間的連接不被破壞。Gibot 等[41]通過成纖維細胞和LEC 細胞膜片，制備出了含有清晰管腔結構的三維組織，其中成纖維細胞構成微管網結構，同時可產生FGF-2 和VEGF-C，有利于毛細淋巴管的形成。相比添加了合成支架的組織工程材料，細胞膜片的生物相容性和生物活性更好，為遞送淋巴內皮細胞修復淋巴管系統提供了一種可行的策略[42]。此外，不同流速的組織間液對淋巴內皮細胞增殖、分化及功能具有重要的調控作用，淋巴內皮細胞應對不同環境刺激而產生特定的功能分化[43]。有研究在纖維支架中設計了一種微液體流動裝置，為毛細淋巴管生成提供適宜的力學刺激，模擬體內微環境中淋巴管生成機制，結果發現毛細淋巴管芽生增多[44]。因此，在組織工程毛細淋巴管的構建中，不僅需要考慮種子細胞和細胞因子，微環境中合適的機械刺激也對毛細淋巴管的生成也起到了關鍵作用。

5.2 組織工程化淋巴結

自體淋巴結移植已被證明是治療淋巴水腫的有效手段，但供區淋巴結的數量有限，而且可能造成供區繼發淋巴水腫。因此，探索組織工程化淋巴結是一條有價值的途徑。目前，淋巴結組織工程的進展集中于模擬淋巴結的微環境以啟動針對癌癥的免疫應答，并治療諸如類風濕性關節炎的免疫缺陷。Giese 等[45]使用了一個包含瓊脂糖和非織造聚酰胺纖維支架、樹突狀細胞、外周血單核細胞的生物反應器系統，試圖工程化改造出具有抗原特異性、細胞因子反應性淋巴細胞的淋巴樣結構。Suematsu 等[46]試圖通過將小鼠胸腺來源的基質細胞和樹突狀細胞嵌入由凍干法制備的不溶性牛腱膠原構成的膠原海綿中，形成了類淋巴樣組織。將其植入小鼠腎包膜下區域后，能夠吸引B 細胞和T 細胞，形成了具有B 細胞和T 細胞簇、高內皮小靜脈樣管腔、生發中心和濾泡樹突細胞網絡的類器官。當植入免疫缺陷小鼠時，類器官還能夠誘導抗原特異性抗體產生，證實其治療免疫缺陷疾病的功能。但其不能完全復制具有輸入和輸出淋巴管的天然淋巴結結構。Cuzzone 等[47]使用脫細胞小鼠淋巴結作為支架來構建組織工程化小鼠淋巴結。結果表明，脫細胞的淋巴結保留了原始組織結構，組織工程淋巴結成功地將白細胞輸送到全身。這項工作顯示了在制備組織工程人淋巴結時使用牛和豬來源的脫細胞淋巴結的可能性。然而，將不同的細胞類型結合到高度組織化的結構中同時保持細胞活力仍然是一個挑戰。

5.3 組織工程化集合淋巴管（Tissue engineered lymphatic collecting vessels，TELCV）

盡管組織工程化毛細淋巴管在小型動物實驗中表現出淋巴水腫修復的優勢，但毛細淋巴管的低容量限制了其對于液體回流和穩態的控制。因此，修復集合淋巴管對于淋巴修復，尤其是嚴重的淋巴水腫，具有不可或缺的作用。由于自體移植淋巴管來源數目的限制，探究工程化管狀支架對于淋巴內皮細胞生長的支持顯得十分必要。盡管可以參照工程化血管的研究，但淋巴管系統缺乏連續基底膜覆蓋，單向運輸及獨特的生理環境均對傳統脈管工程化提出了更大的挑戰[48]。Rudiger 等在1981 年首次利用聚乙醇酸硅樹脂酮支架工程化改造集合淋巴管，在裸鼠模型中顯著改善了淋巴內皮細胞的黏附、遷徙、生長及穩定性，顯示出體外工程化改造集合淋巴管的潛力[35]。另一項研究基于POSS-PCU 促進淋巴內皮細胞增殖，并在材料表面形成2 mm 匯合層[49]。Hadamitzk 等[38]在家豬后肢淋巴水腫模型中探究了Biobridge 在淋巴管生成中的效果。實驗分為Biobridge 加淋巴結，Biobridge 加VEGF-C及對照3 組培養，CT 及電阻率測定顯示僅Biobridge 加淋巴結組產生了具有功能的淋巴管系統，提示VEGF-C 所誘導的淋巴管生成需要一定的方向梯度。與血管不同，淋巴液壓力非常低，因此開發功能性集合管腔支架難度較血管低。相比之下，人工集合淋巴管的主要挑戰是制備具有功能瓣膜的模擬結構。功能性TELCV 需要對淋巴液流動有反應，并能預防淋巴液逆向流動。TELCV 內部的LECs、平滑肌外層和雙葉瓣對于促淋巴液輸送，防止回流至關重要[50]，而這種功能性瓣膜尚未在組織工程化淋巴管中進行應用。

6 展望

相比血管系統，淋巴管系統的重要性經常被忽視。針對淋巴系統損傷和缺陷導致的各種疾病，目前臨床的治療方法還遠無法滿足需求。隨著對淋巴生物學的進一步理解，已經發現了調節淋巴再生和改善功能的生長因子。對LECs 的分離和培養使我們能夠在實驗室制備培養系統和支架并產生人工淋巴結構。未來淋巴系統組織工程發展的關鍵包括建立淋巴管，促進這些淋巴管與全身結構的連接，設計功能性淋巴結構，如淋巴結，并促進淋巴系統的血管化。理想的淋巴組織工程可以通過支架和人工淋巴器官進行淋巴循環，以及完成通常由淋巴系統負責的所有功能，例如脂肪運輸、免疫細胞運輸和組織間液調節等。未來的挑戰將是制備具有功能的淋巴器官并可以在臨床進行植入，開發可以連接并整合到患者自身淋巴網絡的組織工程淋巴管網。此外，血管組織工程已經取得了相當大的進展，需要將其成果整合到淋巴組織工程中，以再生功能齊全且血供良好的淋巴結構。盡管開發和植入功能性淋巴結構的目標仍然受到很多制約，但隨著再生醫學和組織工程技術的不斷發展，制備組織工程淋巴組織變得越來越可行，可以期待在未來用于淋巴系統疾病的治療。