促進間充質(zhì)干細胞外囊泡產(chǎn)生的研究進展

鄭毅 許鵬 劉凱

【提要】 細胞外囊泡（EVs）治療是一種前景廣闊的臨床治療方法，可以規(guī)避間充質(zhì)干細胞（MSCs）治療的多種潛在風險。但基于治療目的需要大量EVs，而EVs 的產(chǎn)量較低難以滿足需求，需要開發(fā)促進EVs 產(chǎn)生的方法。本文圍繞近年來促進EVs 產(chǎn)生的新方法與進展進行介紹，為實現(xiàn)EVs 的高效、大量生產(chǎn)并應用于再生醫(yī)學治療領域提供參考。

近20 年來，間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）在再生醫(yī)學領域越來越受到關注，應用于臨床的MSCs包括骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪來源間充質(zhì)干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、臍帶間充質(zhì)干細胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSCs）等。MSCs 具有自我更新能力，可以分化成多種細胞譜系，并且可以分泌多種生長因子，表現(xiàn)出強大的再生潛能。研究發(fā)現(xiàn)，局部應用ADSCs 可以加速傷口愈合、促進骨關節(jié)炎恢復[1-2]。然而，最近的研究表明，MSCs 并非通過分化成其他細胞來修復受損組織，而是通過其介導的旁分泌機制[3]，如細胞因子以及細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）等，來調(diào)控受損的細胞[4-5]，而EVs 是MSCs 發(fā)揮組織修復與再生效應的關鍵產(chǎn)物之一[6]。

相較于MSCs，EVs 在臨床應用中具有諸多優(yōu)勢。多項動物研究表明，EVs 可以減少心肌梗死面積[7]、減輕肝臟損傷[8]、改善受損的腎功能[9]、促進卒中恢復[10]與皮膚創(chuàng)面愈合[11]等。還有研究者將EVs 用于COVID-19 的治療[12]。此外，EVs 可作為疾病診斷的標志物[13]，或作為天然來源的生物載體實現(xiàn)藥物遞送與釋放[14]。基于再生治療目的，EVs 的生產(chǎn)需要培養(yǎng)大量的MSCs。然而，細胞分泌EVs 的產(chǎn)量過低，難以達到治療的需求。例如，嚙齒動物模型所需的EVs 相當于48 h 內(nèi)從200 萬個MSCs 收集的EVs 數(shù)量[15]，而按照比例，應用于人體的治療量可能需要數(shù)億細胞來生產(chǎn)[16]。因此，有必要研究新的方法來促進EVs 的產(chǎn)生。目前的研究主要聚焦在如下幾個方面：第一，提高單位數(shù)量細胞釋放EVs 的數(shù)量。通過對細胞進行物理或化學等外源性刺激，可以促進EVs 的產(chǎn)生[17]。第二，通過各種立體培養(yǎng)方法增加培養(yǎng)空間中細胞的數(shù)量，從而提高獲取EVs 的效率，并減少每個細胞所需的培養(yǎng)基體積。第三，解決目前分離方法效率低、提取的EVs 易受破損等問題[18]，從而提高EVs 的分離效率。本文將圍繞近年來促進EVs產(chǎn)生的新方法與進展進行介紹，為實現(xiàn)EVs 高效、大量生產(chǎn)并應用于再生醫(yī)學治療領域提供參考。

1 外源性刺激促進細胞釋放EVs

1.1 血清剝奪

血清剝奪是最常用，簡單的促進MSCs 釋放EVs 的外源性刺激方法[19]。Li 等[20]發(fā)現(xiàn)，使用血清剝奪培養(yǎng)基與含10%無EVs 血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系（Neuro2a）和富含運動神經(jīng)元的胚胎小鼠脊髓細胞與小鼠神經(jīng)母細胞瘤的融合體（NSC-34），48 h 后，血清剝奪培養(yǎng)基的EVs 產(chǎn)量始終高于10%無EVs 血清的培養(yǎng)基的產(chǎn)量。Bost 等[21]的進一步研究表明，在培養(yǎng)基中添加血清培養(yǎng)人胚胎腎293 細胞（Human embryonic kidney 293 cell line，HEK-293）的衍生株HEK-293T 細胞，不利于細胞EVs 的釋放。為了探究哪些成分會影響細胞EVs 釋放，通過提取出血清中的EVs 與白蛋白等大分子物質(zhì)單獨作用于細胞，發(fā)現(xiàn)細胞EVs 的產(chǎn)生受到抑制。對血清剝奪培養(yǎng)與10%血清培養(yǎng)的HEK-293T 細胞轉(zhuǎn)錄的分析表明，血清剝奪培養(yǎng)使細胞的神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，而使用神經(jīng)酰胺抑制劑GW4869 處理細胞可顯著降低血清剝奪培養(yǎng)細胞EVs 的產(chǎn)生，提示神經(jīng)酰胺依賴性的EVs發(fā)生途徑是血清剝奪促進EVs 釋放的關鍵機制。然而，血清剝奪過久的細胞常表現(xiàn)出不良的生長狀態(tài)，無法持續(xù)性地生產(chǎn)EVs。但因其操作簡單易行，大量的研究仍在提取EVs 前對細胞進行血清剝奪處理[20]。

1.2 低氧

低氧刺激也是促進細胞釋放EVs 的一種較常見的方法。多項研究表明，1%或0.1%的低氧條件可以促進乳腺癌細胞分泌EVs[22]；0.5%的低氧條件可以促進骨髓干細胞分泌EVs。低氧狀態(tài)下，低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達升高，進一步激活下游靶標nSMase2，而nSMase2 是EVs 生物發(fā)生與釋放的關鍵因子之一，提示低氧可能是通過HIF-1α 與nSMase2 的一系列通路的激活，促進了細胞分泌EVs[23]。低氧還可影響并改變多種細胞基因的表達，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT-1）、表皮生長因子受體（EGFR）等，從而增加這些受體的激活或?qū)е率荏w聚集，進一步誘導內(nèi)吞作用并促進EVs釋放[24]。低氧不僅能促進EVs 的釋放，經(jīng)過低氧刺激后細胞分泌的EVs 具有更強的促進血管生成、促進脂肪移植物成活、促進糖尿病創(chuàng)面恢復[25-27]等生物學效應。

1.3 pH 改變

Ban 等[28]發(fā)現(xiàn)，相比中性培養(yǎng)基，將HEK-293 細胞在酸性培養(yǎng)基中孵育30 min，其分泌的EVs 內(nèi)容物中蛋白和核酸的濃度顯著增加，EVs 的標志物CD9、CD63 和HSP70 明顯增多；而堿性培養(yǎng)基中未發(fā)生明顯改變。Parolini 等[29]觀察到酸性微環(huán)境可以促進黑色素瘤細胞EVs 的釋放與攝取。Nakase等[30]的研究表明，低pH 培養(yǎng)Hela 細胞可能通過影響MVB的胞吐來影響EVs 的釋放；低pH 會改變Hela 細胞分泌的EVs 相關性狀，包括其蛋白含量、zeta 電位等，而這些改變可能影響了Hela 細胞對EVs 的再攝入，從而增加了EVs 在上清液中的數(shù)量，但其確切的機制仍不清楚。此外，低pH 促進細胞分泌EVs 是否對所有細胞具有普適性，以及針對不同的細胞何種pH 條件最適宜等問題仍需進一步研究。

1.4 機械應力

大量研究表明，機械應力的變化能夠改變細胞，影響其分化和轉(zhuǎn)歸。例如，壓力可以促進MSCs 向軟骨分化，促進軟骨細胞的生長與細胞外基質(zhì)表達[31]。最近的研究將生物反應器模擬體內(nèi)的機械力與液體剪切力，發(fā)現(xiàn)這些刺激可以促進細胞分泌EVs。Patel 等[32]構(gòu)建了一種3D 灌注生物反應器系統(tǒng)，可以模擬生理狀態(tài)下血流動力學應力。培養(yǎng)3 d 后，人真皮微血管內(nèi)皮細胞（Human dermal microvascular endothelial cells，HDMEC）分泌EVs 的產(chǎn)量相比靜態(tài)培養(yǎng)增加了100 倍以上，EVs的CD63 的表達增加了14 倍。Guo 等[33]設計了一種具備拉伸收縮功能的灌注生物反應器，培養(yǎng)體內(nèi)來源的干細胞，發(fā)現(xiàn)細胞分泌的EVs 產(chǎn)量明顯增加。機械應力可以增加細胞內(nèi)機械敏感性YAP 蛋白的表達，該蛋白在細胞核中的積累可以進一步激活Wnt 通路，Wnt 通路的激活可以促進細胞釋放EVs[34]。

1.5 電刺激

電刺激具有多種生理學功能，生物體內(nèi)的電刺激可以刺激組織的發(fā)育與再生，促進細胞分泌多種細胞因子，也能促進軟骨分化與成熟等[35]。Fukuta 等[36]的研究表明，低水平的電刺激（0.3～0.5 mA·cm-2）可以通過影響鼠黑色素瘤細胞系（B16F1）與鼠成纖維細胞系（3T3 Swiss Albino）中的Rho GTPase 蛋白、Rab 家族蛋白與細胞內(nèi)鈣離子水平來增加內(nèi)吞與EVs 釋放，提高EVs 產(chǎn)量。另外，較強的瞬時電刺激可導致細胞膜穿孔，雖然瞬時電刺激常用于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA 或特定藥物，但該方式也可以使EVs 的釋放增加數(shù)十倍[37]。因此，電刺激理論上可以在促進EVs 分泌的同時，轉(zhuǎn)入需要的治療藥物，實現(xiàn)靶向且高效的EVs 生產(chǎn)。

1.6 細胞因子與化學藥物

EVs 的產(chǎn)量也可以通過使用一些細胞因子與化學藥物來提高。例如，部分抗炎類藥物（乙酰水楊酸、塞來昔布和氯喹等）可以促進細胞分泌EVs[38]。將特定細胞（如中性粒細胞）與細胞因子使用TNF-α 孵育，可以促進EVs 的分泌。這些細胞因子與化學藥物可以影響細胞的肌動蛋白功能與細胞膜流動性，還可以改變細胞內(nèi)鈣離子濃度，從而影響EVs 的釋放[39]。但由于引入了外來化學藥物或試劑，可能對EVs 的成分與純度造成影響，是否可以應用于EVs 的大量生產(chǎn)仍有待進一步研究。

1.7 其他

Chen 等[40]發(fā)現(xiàn)，熱應激處理后，腫瘤細胞分泌的EVs 明顯增加。Bagheri 等[41]使用80 J·cm-2功率強度的低強度激光（Low-level laser irradiation，LLLI）照射，可以通過誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬，并促進細胞內(nèi)Wnt 信號通路的激活和GTPase 的轉(zhuǎn)錄來增加EVs 的分泌。目前，許多方法仍停留在理論階段，在未來的轉(zhuǎn)化應用中，仍需探討其機制與原理，并嘗試構(gòu)建標準化的生產(chǎn)流程。

2 提高細胞培養(yǎng)效率

3D 培養(yǎng)是提高細胞培養(yǎng)效率最常用的方法，可在有限的細胞培養(yǎng)空間內(nèi)，擴展細胞培養(yǎng)的數(shù)量。最早提出的3D 生物反應器是2008 年Integra CELLine 的“燒瓶”生物反應器[42]，可使培養(yǎng)的間皮瘤細胞的EVs 產(chǎn)量提升12 倍，且EVs 的形態(tài)、表型和免疫功能與對照組類似。隨后，更多種類的3D 生物反應器被開發(fā)應用。Patel 等[32]構(gòu)建了多層支架結(jié)構(gòu)的3D生物反應器，在增大培養(yǎng)面積的同時模擬體內(nèi)的流體剪切力，明顯促進了EVs 產(chǎn)生。3D 生物反應器通過內(nèi)置的傳感器，還可實現(xiàn)自動化的微環(huán)境控制，可以更好地進行營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，以及對O2、CO2 和溫度的控制[43]。

最近，以中空纖維為代表的新型3D 生物反應器逐漸成為研究的熱點。中空纖維生物反應器有別于傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶，是一種在封閉系統(tǒng)內(nèi)將細胞區(qū)域與培養(yǎng)基區(qū)域分隔開來的三維反應器。由于中空纖維的特殊性，細胞可以在系統(tǒng)中長時間保持良好形態(tài)而無需傳代；中空纖維可以在單位空間內(nèi)培養(yǎng)大量細胞，并將EVs 富集在外部隔室的培養(yǎng)基內(nèi)，同時半透膜避免了內(nèi)隔室細胞培養(yǎng)基中血清來源EVs 的污染[44]，具有獨特的優(yōu)勢。

3 改善EVs 的提取方法

隨著分離提純技術的快速發(fā)展，目前已經(jīng)有許多提取EVs 的方法。這些方法基于EVs 不同的特性（如密度、形狀、大小和表面蛋白等）來進行分離，每種技術各有優(yōu)劣。

差速離心法是目前最常用的EVs 提取方法[45]。然而，雜質(zhì)蛋白的混雜可能會影響其應用及成分分析[46]。此外，較大的離心力可能對EVs 的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良的影響[18]；每次離心體積較小，離心時間較長，限制了該方法在大規(guī)模提取EVs 中的應用。

超濾法是基于膜過濾的一種分離方法，操作簡便[47]。但是，超濾時的壓力可能導致EVs 破裂，影響其生理學功能與成分[48]。此外，囊泡在膜上大量堆積與吸附，會導致膜的堵塞與產(chǎn)量損失[49]。其中，尺寸排阻色譜法基于重力作用，可以保持EVs 的結(jié)構(gòu)與原有生物活性[50]，但其能處理的樣本體積有限；基于免疫結(jié)合原理的有免疫吸附法[51]，但產(chǎn)量低成本高[45]；基于親疏水原理的共沉淀法[52]，產(chǎn)量較高[53]，但可導致其他雜質(zhì)的共沉淀[54]，引入的外來化學物質(zhì)不利于EVs 的臨床應用。

最近，一種新的基于微流體膜過濾的方法（TFF）使EVs的分離提取技術得到進一步發(fā)展[55]。TFF 的原理與超濾法類似，但超濾法的直流過濾易導致靠近膜表面的液體顆粒積聚，引起膜阻塞并降低過濾效率，最終導致膜破裂[56-57]。TFF引入了切向流分量，防止顆粒在膜表面形成高濃度液層，可以使過濾效率保持穩(wěn)定，避免以上問題的產(chǎn)生。將TFF 與其他EVs 分離提純的方法結(jié)合，可以顯著提高EVs 的產(chǎn)量并減少損失。Nordin 等[58]開發(fā)了一種TFF 結(jié)合尺寸排阻色譜的提取方法，可收獲高達50%～80%的EVs（理論產(chǎn)量）。Haraszti 等[59]聯(lián)合使用微載體3D 培養(yǎng)方法與TFF 提純方法，總體使EVs產(chǎn)量提高了140 倍。Kim 等[60]開發(fā)了一種完全封閉的雙循環(huán)TFF 芯片（dcTFF），可收獲所需粒徑區(qū)間的EVs。盡管TFF 同樣難以分離與EVs 粒徑相似的雜質(zhì)，但TFF 可以處理大體積（＞1 L）的樣本，非常適合用于大量生產(chǎn)EVs；此外，由于保持了過濾效率的穩(wěn)定性，TFF 提高了批次間的一致性[61]。因此，TFF 可能是未來更適合臨床使用的EVs 提取方法之一。當然，TFF 設備仍需要進一步發(fā)展，其可擴展性、驗證方法和標準化等問題仍有待進一步解決與完善。

4 總結(jié)與展望

過去的數(shù)年間，隨著EVs 研究的發(fā)展與深入，其在再生治療中的優(yōu)勢正逐漸顯現(xiàn)出來，而基于治療目的，需要高效、大量地生產(chǎn)EVs。為了克服EVs 產(chǎn)量低的問題，已經(jīng)有多種策略用于促進EVs 的產(chǎn)生。雖然許多方法仍處于理論階段，或僅局限于特定的細胞或應用場景，但隨著研究的進一步發(fā)展，距離高效、大量地生產(chǎn)EVs 的目標將更加接近。在今后的研究中，需要探究EVs 生產(chǎn)方法對EVs 質(zhì)量與生物學效應的影響，摸索與建立EVs 產(chǎn)生的流程與標準，滿足未來再生醫(yī)學的臨床需求。