3D 打印“生物活性支架”過程中細胞損傷的研究進展

余海洋 趙紅斌 劉純 賈中芝

【提要】 近年來，3D 打印“生物活性支架”已成為研究的熱點。雖然3D 打印生物活性支架取得了巨大的進步，但在生物活性支架打印過程中，多種因素會導致細胞損傷，甚至細胞死亡，主要包括以下幾種原因：①不同的打印方式產生的細胞損傷方式及損傷的程度各不相同，如熱損傷、擠壓損傷、剪切和拉伸應力損傷等；②接收基板是否有涂層，以及涂層的厚度和原材料種類等。接收基板的涂層可以起到細胞培養液和碰撞緩沖的雙重作用，會對細胞損傷產生一定程度的影響，細胞損傷的程度直接影響了3D 打印生物活性支架的生物活性。本文對生物活性支架打印過程中的細胞損傷的研究進展進行綜述。

3D 打印“生物活性支架”是使用活細胞與支架材料混合成“生物墨水”，然后通過3D 打印的方式獲得生物活性支架，如皮膚支架、骨支架、軟骨支架等[1-4]。隨著3D 打印技術和材料學的快速發展，3D 打印生物活性支架取得了巨大的進步[5]，但在3D 打印過程中，細胞將承受擠壓、高溫及碰撞等多重因素作用，如果損傷超越細胞承受能力，就會引起細胞的死亡[6]。因此，如何降低3D 打印過程中對細胞的損傷，維持細胞的活性，是目前3D 打印“生物活性支架”過程中的熱點和難點[7]。

在生物活性支架的3D 打印過程中，有多種因素會導致細胞損傷，甚至導致細胞死亡[8]。本文對生物活性支架3D 打印過程中細胞損傷研究的進展進行綜述。

1 3D 打印方式對細胞損傷的影響

目前，適用于生物活性支架的3D 打印方式主要有擠壓式3D 生物打印、噴墨3D 生物打印、激光輔助3D 生物打印和聲控3D 生物打印。其工作原理各不相同，但在生物活性支架3D 打印過程中，均會對活細胞產生一定的損傷。

1.1 擠壓式3D 生物打印

擠壓式3D 生物打印是以機械力或氣壓等為驅動力，從噴頭擠壓出“生物墨水”，從而構建生物活性支架。該方式打印速度較快，有利于控制支架的孔隙結構和細胞的密度，適用于高黏度和高細胞密度的生物墨水打印。該技術在墨水材料種類、生物相容性、三維成型能力等方面具有綜合優勢，是使用最為廣泛的生物活性支架打印方式[9]。

擠壓式3D 生物打印的壓力驅動會導致細胞損傷，甚至細胞死亡[10]。打印過程中，生物墨水從墨水倉被擠壓至噴嘴、平臺，管道內壁會對生物墨水產生一定的剪切力[11]。這種印刷機制會使細胞承受持續的剪切力和拉伸應力，從而導致細胞膜破裂和細胞受損，且細胞損傷程度與剪切力的大小相關[12]。通常情況下，剪切力與距管道內壁的距離呈負相關；另外，生物墨水的黏度、擠壓力的大小、噴嘴的內徑也直接影響剪切力的強度，從而影響細胞的損傷程度[13]。有研究發現，擠壓式3D 生物打印墨水的溫度對細胞的損傷也有一定的影響[14]。

因此，剪切力是擠壓式3D 生物打印過程中導致細胞損傷的關鍵因素。在擠壓式生物打印過程中，如何在保持細胞活性（降低細胞損傷）和打印速度的同時，又能降低壓力并減小噴嘴尺寸是該打印方式的主要研究內容。此外，3D 生物打印過程中控制好生物墨水的黏度（不宜過高或過低），尋找合適的黏彈性區間，也是實現良好3D 生物打印的重要步驟。

1.2 噴墨生物打印

噴墨生物打印是通過使用計算機控制，然后將生物墨水以液滴的形式精確打印在接收基板上，然后利用紫外光層固化，最終獲得3D 生物活性支架[15]。該打印方式獲得的3D 生物活性支架內的細胞活性比較高，而且成本相對較低，但無法打印黏度較高的生物墨水，并且細胞在培養液中的分散程度也很難控制，且打印效率較低[16]。

噴墨打印主要采用微熱泡或壓電驅動器噴射液滴來實現生物活性支架的3D 打印。熱氣泡的產生和壓電的變形會對細胞造成一定的損傷，因此控制打印工藝參數是降低細胞損傷的關鍵因素[17]。熱噴墨打印時，加熱元件迅速達到高溫，使噴嘴處的生物墨水形成氣泡，氣泡就會產生壓力使一定量的生物墨水液滴克服表面張力被擠壓出孔口，然后從孔口噴射出來，噴嘴的最高溫度在300 ℃以上，極易造成生物墨水中細胞的熱損傷；另外，在氣泡形成與噴射過程中，生物墨水中的細胞還會受到擠壓損傷[15]。反之，壓電驅動器噴射方法，打印脈沖在10～25 μs 時，細胞的存活率高達96%，表明壓電噴射對細胞的損傷較微熱泡驅動方式小[18]。

噴墨打印的噴射速度不同，產生的剪切應力也不同，導致的細胞損傷程度也不同[19]。當噴射速度為5～8 m/s 時，細胞受到的剪切應力的數值比較穩定，當噴射速度達到10 m/s時，細胞受到的剪切應力增幅逐漸變大，尤其是在40 m/s 之后，細胞受到的剪切應力增長越來越快[17]。還有研究表明，適當增加打印時間的間隔，也可以有效減少細胞在著落過程中的受力，從而降低細胞的機械性損傷[17]。

1.3 激光輔助生物打印

基于激光誘導正向移動的技術，利用聚焦激光脈沖產生的高壓氣泡，將生物墨水推向接受基板，從而構建生物活性支架。該打印技術在維持細胞活性的同時，實現了生物墨水的精確和高分辨率3D 打印，常用于高黏度的生物墨水和含有高濃度細胞的3D 生物打印，但是成本相對高，效率較低，且不利于多種細胞的混合生物打印[20-21]。

通過激光束使局部產生高溫，進而使細胞懸浮液氣化并產生氣泡，最后噴射出細胞液滴，該過程中細胞同樣會受到一定程度的熱損傷[18]。另外，其噴射速度高（50～1 000 m/s），噴射時細胞承受的壓力大（8～15 MPa），在細胞著落在接受基板上時，細胞與接收基板的物理碰撞會導致細胞剪切損傷（如細胞膜破裂等），甚至細胞死亡[23]。研究發現，細胞損傷程度隨著激光能量密度的增加而增大（85～1 500 MJ/cm2）[23]；即使對于耐受力較強的酵母細胞，仍有10%～55%的細胞在噴射后發生死亡[23]。

1.4 聲控生物打印

采用表面聲波控制，在壓電基板上周期性排列著一系列的聲控發生器，由圓形的傳感器組成，并組成二維陣列，同時需要打印的細胞懸浮液在壓電基體上。由于傳感器產生的聲波是圓形的，這些聲音就會在細胞懸浮液表面形成焦點，當焦點處的聲壓超過液體表面張力時，在空氣與液滴的接口處就會產生聲控打印液滴。在打印過程中，雖然細胞液滴不會受到高溫、高壓的影響，但是在打印含單細胞液滴時，該技術有時會打印出不含細胞的液滴，其在打印單細胞時的可靠性較弱，重復性較差。

研究表明，細胞在聲控生物打印后的存活率高達89.9%[24-25]，可見該打印方式對細胞的損傷程度較小，但該打印方式損傷細胞的機制尚不清楚，仍需深入研究。

2 接收基板對細胞損傷的影響

接收基板的作用是接受被打印的細胞、承載構建的生物活性支架。接收基板上是否有涂層、涂層的厚度以及涂層的原材料，均會對細胞損傷產生一定的影響。目前，最常用的涂層是水凝膠，水凝膠可以起到細胞培養液和碰撞緩沖劑的雙重作用[26-27]。

2.1 接收基板的涂層及其厚度

對于高速3D 生物打印技術，接收基板有無涂層材料及其涂層材料的厚度均對細胞的受力有一定的影響[17]。在激光輔助生物打印過程中，使用不加涂層的石英接收基板，只能獲得5%的細胞存活率，當在基板上涂抹了20 μm 的水凝膠時，細胞的存活率就提高到了50%，水凝膠的涂層為40 μm時，細胞的存活率就提高到了95%[27]。研究發現，當接收基板上沒有任何涂層時，即接收基板上無緩沖/培養物質，生物墨水中的細胞被打印到接收基板時承受的應力和剪切應力均為最大；當接收基板涂有水凝膠時，生物墨水中的細胞被打印到接收基板時承受的應力和剪切應力變小，且隨著水凝膠涂層厚度的增加，應力和剪切應力均逐漸減小，即使接收基板上只涂一層薄薄的水凝膠（20 μm），都可以顯著降低生物墨水中細胞承受的應力和剪切應力，降低細胞機械損傷的程度[18]。因此，接收基板上的涂層及其厚度均直接或間接影響細胞的損傷程度。

2.2 接收基板涂層的原材料

接收基板涂層的原材料對細胞的損傷也有一定的影響。在相同的3D 打印條件下，當接收基板的涂層為液態培養液時，細胞的存活率為93%，而接收基板的涂層為半固態瓊脂培養基時，細胞的存活率增加至96%[18]。因此，接收基板涂層原材料的性質也在一定程度上影響細胞的損傷。

3 結論

在生物活性支架打印過程中，多種因素會導致細胞損傷，不同的打印方式引起的細胞損傷程度各不相同，如熱損傷、擠壓損傷、剪切和拉伸應力損傷等；接收基板是否有涂層以及涂層的厚度和原材料種類等。在生物活性支架打印過程中，如何減少細胞損傷，仍需要進一步對打印方式、打印參數、細胞著落過程中的受力情況等展開深入的研究。