水和食品中衛生細菌的快速檢驗研究進展

王婷

（北流市疾病預防控制中心，廣西 北流，537400）

當下，由于飲用水及食品中的致病菌污染引發的傳染病及食物中毒等不良事件時常發生。因此需對水果、蔬菜、肉類等食物定期實施細菌的檢測，以對細菌污染的狀況進行了解。若僅采用單純的常規檢驗方式，則檢驗周期較長，無法在較短的時間內快速得出鑒定結果。因此，多種快速檢驗方式應運而生。只有采用快速檢驗方式對大量的食物樣品及飲用水實施檢驗，及時發現問題并實施干預措施才能有效避免各種腸道傳染病及食物中毒等不良事件的發生。本文對飲用水及食物中衛生細菌的快速檢驗進展綜述如下。

1 分子生物學檢驗方式

聚合酶鏈反應是近年來應用于檢驗及研究不同致病微生物的新型技術。目前對于該種檢驗方式的研究也在不斷的深入，如派生出定量、多重及免疫PCR 等。但PCR 技術檢驗細菌的原理是采用細菌中各菌種的核酸序列，從而設計出相關引物，對細菌核酸實施擴增，使用核酸檢測儀及凝膠電泳對擴增結果進行觀察。

1.1 多重PCR丁衛平[1]等對食品中的單核細胞增生性李斯特氏菌的hlyA 及iap 實施多重PCR，分別擴增出131-bp 及234-bp片段。汪斌[2]等利用大腸桿菌所特有的eaeA 基因設計的多重引物，同時擴增出DNA 及1087bp 序列。多重PCR 檢驗方式具有較高的準確度、特異度及靈敏度，且能快速得出檢驗結果。

1.2 免疫-PCR楊艷[3]等先采用免疫磁性顆粒對肉類中沙門氏菌實施分離，后再對其應用PCR 予以檢驗。所使用的的免疫磁性顆粒上包被羊抗鼠lgG 的抗體并再與單克隆抗體相連。實驗過程中，取1ml 經過培養的增菌液，后加入免疫磁性顆粒5ul，并持續搖晃10min，后在磁場的作用下使磁顆粒逐漸向磁極積聚，去除上清液。采用無菌生理鹽水對磁顆粒實施清洗。磁顆粒重懸于20ul 水中，加熱至90℃，5min 以使細菌裂解，使用離心法將磁顆粒進行去除，將上清液用于PCR 檢驗。研究結果顯示，使用緩沖蛋白胨水增菌培養24h 最低檢驗限為1g 肌肉染有0.1CFU 的沙門氏菌。

1.3 隨機擴增多態性一般微生物遺傳物質均有較高的特異度，但時常種屬相似的微生物間有同源序列，使按照某一種細菌DNA 片段設計出的引物，時常對其他細菌也可擴增出一樣的產物，使檢驗結果出現假陽性的現象。此時應用隨機引物可將兩種致病菌經采用PCR 擴增出不同的DNA 圖譜，按照不同圖譜的特征對致病菌進行區分。相關研究學者曾使用不同致病菌，經PCR 檢驗大腸桿菌O157：H7eaeA 基因的引物的特異性，發現豬霍亂沙門氏菌也可擴增出一樣的產物[4]。由經采用1 條S571隨機引物對兩個致病菌實施PCR 檢驗，對擴增產物進行凝膠電泳，兩種致病菌DNA 圖譜存在明顯不同，進而可準確的將其區分。

1.4 采用PCR 研究致病菌致病機理陳建林[5]等采用PCR 檢驗對副溶血性弧菌的耐熱直接溶血素及耐熱、直接溶血素的因素實施檢驗，其認為判定弧菌致病機理的依據為耐熱溶血素。副溶血性弧菌存在耐熱溶血素即可致病，神奈川陰性僅在體外條件下未充分表達[6]。應用生物學技術對細菌進行鑒定不僅有較高的準確性，其能對細菌的致病機理從分子水平上實施進一步研究。

2 免疫學檢驗方式

免疫學檢驗檢驗儀器相對價廉，操作過程簡便，實用性較好，在衛生檢驗方面的應用得到認可。

2.1 酶聯免疫吸附法潘子強[7]等分別應用單克隆及多克隆抗體的酶聯免疫吸附法檢驗大腸桿菌 O157：H7，其不僅能應用于臨床檢驗，同時能應用于水及食物細菌檢驗中。酶聯免疫吸附法操作簡單、快速，且具有較高的準確性及特異性，是對大量樣品實施診斷的理想檢驗方式。

2.2 免疫膠體金技術免疫膠體金技術是一種新型的免疫學檢驗技術，霍亂主要經糞-口途徑傳播。李倩茹[8]等以膠體金技術作為基礎，設計出一種檢驗霍亂弧菌的試劑盒。在檢驗過程中，先使細菌與單克隆抗體結合，再使其與多克隆抗體結合，使得大量的致病菌被捕獲，因細菌與有鮮紅的膠金顆粒結合，進而可通過肉眼直接觀察檢驗結果。彭志蘭[9]等采用相似的膜條層析免疫法對霍亂弧菌實施檢驗，在較短的時間內即可判斷檢驗結果。

2.3 免疫磁性分離技術張蕾[10]等將沙門氏菌的免疫磁球與其他培養基進行結合應用，對生禽中的沙門氏菌實施分離，免疫磁性分離技術可顯著提升致病菌的檢出率。蘇濤[11]等該種檢驗技術與比色法測定PCR 產物相結合，對飲用水及食物樣品中的耶爾森氏菌實施分離及檢驗。多種檢驗技術的聯合應用，可實現檢驗的完全自動化，可顯著減少檢驗人員的工作量，適合在大量樣品檢驗中應用。

3 生物傳感器技術

生物傳感器技術使用生物體本身作為敏感材料，通過合適的方式固定于分子識別元件，在于信號轉換器件組成的傳感器[12]。該種技術在微生物代謝及細菌計數的生物電極檢驗中的應用得到認可。井良義[13]等采用氧傳感器對細菌數進行快速檢驗，使其達到實用程度。凡是含有過氧化氫的細菌均可出現該種反應，該種檢驗方式最低檢驗限為104個/ml 細菌。實際檢驗過程中無需實施培養，將被檢樣品制成檢液后即可完成檢驗，適用于單一致病菌的快速計數。

4 顯微染色計數法

顯微染色計數法是將細胞進行染色，借助顯微鏡計算細胞的數量的方式。

4.1 丫啶橙染色計數法相關研究學者曾采用丫啶橙染色法對細菌實施鏡檢，操作步驟為：取水樣本10ml 加入試管中，加入甲醛樣品0.5ml，最后加入丫啶橙溶液2ml，染色3min，后將細菌過濾至濾膜上，將1 滴香柏油滴入，將蓋玻片蓋上，置于顯微鏡下計數菌數[14]。通過對視野及濾膜面積進行測量計算出樣本中所含的細菌數量。該種檢驗方式可因細菌在濾膜表面分布不均勻造成樣品體積較小的細菌數量出現偏差。

4.2 活菌直接計數法活菌直接計數法的原理是利用吡哌酸及吡咯酸對細菌DNA 的復制產生抑制，造成其無法分裂，但不會對細胞內其他合成途徑的轉運造成影響，在一定濃度營養物質存在的情況下，菌體生長，變大，通過熒光染色，易計數出來[15]。采用DVC 技術的發現細胞還存在新的存活方式：活的非可培養狀態。在液體中無法繁殖成一定大小的菌落，并不說明其已經死亡，有可能是變成活的非可培養狀態，僅是在培養環境下無法進行繁殖[16]。一旦培養條件適宜，病原菌復蘇后仍具有較強的致病能力。

5 微菌落計數法

近年來有諸多研究學者對微菌落計數進行進一步研究及應用。因其可通過短時培養，借助顯微鏡即可觀察檢驗結果，具有較高的準確性，通過將其完善，可用于基層對水及食物中的細菌實施快速檢驗[17-18]。鄒翔[19]等采用聚碳酸酯濾膜對水樣品實施過濾，并在營養瓊脂平板上培養3h，將濾膜上的菌落實施加熱及固定，并使用復紅染色實施漂洗，借助顯微鏡對菌落進行觀察。該種檢驗方式重復性好，且與瓊脂傾注平板法相比，檢測大腸菌群，檢驗結果無明顯差異。

不同的快速檢驗方式均具有不同的優勢及缺陷。整體來看，快速檢驗方式在衛生檢驗方面的應用得到認可，有望成為對水及食物中細菌快速檢驗的方式，微菌落及顯微染色計數法最可能實現，其能快速的檢驗出被檢樣品中衛生狀況。