食源性病原微生物快速檢驗技術的應用與研究進展

吳青梅

（扶綏縣疾病預防控制中心，廣西 崇左，532199）

食源性病原微生物的檢測，先進行前增菌，再用選擇性培養基進行分離培養，并通過體外人工進化程序篩選，可明顯提升檢測的靈敏性及準確性，這也是目前食源性病原微生物快速檢測技術發展面臨的挑戰，目前從自然界微生物中篩選某菌種一般需8～48 h，占用較長的時間，采用提高靈敏度的措施，在細菌檢測中只需短時間增菌，達到檢測的目的，這是快檢方法發展的一個必然趨勢；另外，常規方法對實驗室常規檢測中不同目標微生物增菌，增加工作量和工作難度，檢測效率還不高，快檢技術需要解決對實驗數據有一定的干擾非優勢菌的檢驗問題[1]。近年來，靈敏度高且快速的食源性致病菌檢測方法不斷完善，它需要利用生物化學、微生物學、細胞生物學進行檢測，將朝著高靈敏度、多標記、多殘留、高通量方向發展[2]。

1 食源性病原微生物快速檢驗技術

1.1 食源性病原微生物快速檢驗免疫膠體金技術免疫膠體金技術以膠體金作為示蹤標記物，應用于抗原抗體反應的免疫學檢測技術，它是20 世紀60 年代發展起來的一種新型體外快診斷方式[3]。膠體金技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡捷等特點，在臨床診斷，環境污染，食品安全檢測中得到了日益廣泛的應用，當前這項技術較少應用于微生物檢測中，往往需要計算檢測的靈敏度、特異性問題，一般靈敏度達到1×106CFU/mL，5 min 內顯示結果，但是，對于致病性微生物的監測有沙門氏菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌等是不允許檢出的，此方法不能取得實際成效及推廣應用價值[4]。

目前，有研究將免疫測定技術與PCR 結合建立免疫-PCR 免疫膠體金技術，可獲得較高的檢測靈敏度和特異性。劉志科，楊寧寧，徐明國，等[5]研究中PCR 鑒定用雞白痢沙門氏菌特異性引物進行PCR 檢測，并在大腸桿菌中進行表達、鑒定，最終得到了invA 融合蛋白，作為進行抗原抗體反應的免疫檢測手段，這種標記物的制備方法顯著提升現有分析方法的靈敏度及特異性，降低假陽性率；并在此基礎上使生物膠體金銀染技術迅速發展起來，設計與目標微生物沙門菌invA 基因，在經醛基化處理的玻片上點加探針，并與提取的靶DNA 或靶探針連接成一條序列與探針特異性序列完全互補，待測核酸雜交靶探針結合巰基化探針生成復合結構，利用膠體金能穩定而又迅速吸附蛋白法而不改變生物活性的特點通過在膠體金上連接巰基化DNA 或蛋白質，銀染放大信號，對目標微生物直接取樣進行分析，特異性強、靈敏度高，該技術可作為DNA 芯片技術的微生物檢測方法，可以實現生物樣本的高通量并行檢測[6]。

1.2 食源性病原微生物快速檢驗免疫磁珠分離技術免疫磁珠分離技術(immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)是一種生物親和技術，將免疫學反應的高度特異性與磁珠特有的磁響應性相結合進行分離富集，用于細胞分離和提純使用，它分離速度快、過程簡單、成本低，完善了傳統的致病性微生物檢測不足，經免疫磁珠分離富集后，使吸附平衡的時間大大縮短，在微生物快檢技術應用中可行性較高，是構成微生物快檢技術開放很重要的一環[7]。免疫磁珠技術結合其他檢測技術應用于食源性病原微生物的檢測，具有很大的應用價值，未來其發展空間也很廣泛。

在研發這項技術方面需要著重探究。納米磁珠質量是影響檢測結果的因素，不易制備，這項技術的重點在于研發優質的納米磁珠。在抗體制備上，將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上將針對特定病原微生物的多抗或單抗偶聯到磁珠微球體上，把修飾后的磁珠和待檢樣品的增菌液混合，通過抗原抗體反應，將目標病原體分離出來[8]。因此，這項技術要應用到食源性病原微生物免疫檢測中很重要的一點就是找到致病菌的特異性抗原靶標。

但因食品基質微生物菌群多樣又復雜，容易影響抗體，選取的抗原靶標不特異，將摻入較多雜菌，雜菌抑制了目標菌的生長繁殖，也導致無法正確檢測到目標菌，目前適用于不同來源的病原微生物檢測技術產品通用性較差，對復雜食品樣品微生物的檢測，靈敏度并不高，不容易穩定，因此，找到合適的特異性較高的抗原靶標，未來這項技術將朝向用多種單克隆抗體技術和其他技術相聯合的方向發展[9]。

1.3 食源性病原微生物快速檢驗飛行時間質譜技術基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorpt ion/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOFMS)對細菌檢測，其原理是每種微生物都有其自身獨特的蛋白質組成，細菌蛋白質與基質結合后，利用激光電離將蛋白提取出來，入檢測器后，便被捕獲，結合各分子量的蛋白質經過飛行管耗時從而對樣品進行定性和定量分析[10]。樣品預處理過程應簡單易行，菌落直接涂于靶板上，也可以使用甲酸萃取法將蛋白后上靶板給提取出來，獲得高質量的分辨率、穿透率高的質譜圖，省去了對樣品預先評估環節，操作簡便快速，使用成本低，結果準確，分辨率更高?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)目前在各個領域應用廣泛，該方法相較傳統的生化反應鑒定操作相對煩瑣、費時，其高靈敏度、自動化的操作，試驗成本較低[11]。

我國常見食源性致病菌的檢測方法成為研究的熱點，構建了對應的檢測體系，為微生物的快速檢測提供了檢測技術。而微生物蛋白質具有龐大的信息量，細菌蛋白質表達具有不確定性，不易進行微生物的溯源分型，過程中需要對數據進行各種處理和歸類，滿足準確分型的應用，目前部分學者對微生物分型追蹤溯源進行研究，往往是完善數據，進行基礎的研究。另外，研究著重從微生物的培養基、菌體前處理等采用MALDI-TO檢測[12]。

MS 技術檢測方法研究，獲得了具有普遍適用性，易于推廣檢測的優化條件；將樣本菌涂在測試靶板上，進行研究，投入成本低，操作方便，獲得可替代的一次性紙靶板，省去繁雜的操作步驟，還能節省檢測洗靶的時間；在不采取前處理措施情況下，對血流感染的細菌快速鑒定[13]。另外，這些技術同時聯合其他技術，有效拓寬了檢測適用范圍。

基于細菌表面蛋白分子量檢測的MALDI-TOF-MS 技術現階段尚且未形成對應的檢測標準，但由于其高準確性、快速周轉時間和低成本等優點，使得該技術在全球微生物實驗室被廣泛采用。而部分菌屬的蛋白質水平不顯著，不利鑒定結果的準確性，若對單增李斯特氏菌和蠟樣芽胞桿進行檢測，不易獲得準確檢驗結果，需要采用二級質譜鑒定方法進行蛋白質的細分，當然需要更加優良的分析系統和軟件支撐。另外，對于各種常見食源性致病菌鑒定和分型方面，仍需要對數據庫和實驗室數據庫都進一步擴展和完善。

2 總結與展望

微生物快速檢測方法無法檢測病毒等方面，其局限性日益顯現，需要增菌培養、檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，因此，不如真菌毒素、違禁食品添加劑等化學性有害物的快速檢測方法應用范圍廣。但近年來，多學科交叉的應用、食品檢驗體量越來越大，使食源性病原微生物快速檢測技術獲得了很大的進展。通過對生產技術在原有基礎上的局部改進和創新，使檢驗效率和檢驗結果的準確性得到了極大提高，并對解決部分專業局限的可行方案進行了優化，使快速檢測技術發展十分迅速，比如應用分子生物學方法不斷完善，這些技術還存在著薄弱環節，需逐步研究改進和拓展，而將引領食源性病原微生物的快速檢測工作的前行。