溶瘤病毒治療肝癌的研究進展

龔濤，琚姝，劉建飛

上海三維生物技術有限公司，上海 201206

肝癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，其預后差、轉移復發率高，患者5 年生存率僅為18%[1-2]。目前針對肝癌的最有效治療手段為手術治療，早期肝癌可通過手術切除和消融技術來進行治療。然而由于肝癌發病機制復雜，臨床早期癥狀不明顯，患者就診時通常已屬于中晚期，錯過了手術治療的最佳時機，因此肝癌的臨床主要治療手段通常采用系統聯合局部（如介入治療、放療等）的綜合治療方案，但由于肝癌對傳統的化療有很高的耐藥性，且放療對肝臟不良反應大，因此尋求有效的肝癌治療手段顯得至關重要[3-4]。近年來，免疫治療成為繼手術、放療、化療和靶向治療之后的一種新型腫瘤治療方法，其通過引導患者自身免疫系統，激活抗腫瘤免疫反應，阻止腫瘤免疫逃逸，達到控制和殺傷腫瘤細胞的目的[5]。針對腫瘤治療的免疫治療包括免疫檢查點抑制劑、過繼性細胞免疫治療、腫瘤疫苗、溶瘤病毒等[6]。隨著免疫治療的迅速發展，溶瘤病毒作為一種新的免疫治療手段，已顯現出較好的治療效果，成為了肝癌治療的研究熱點之一[7]。本文就溶瘤病毒的作用機制及其在肝癌治療中的研究進展進行綜述。

1 溶瘤病毒的定義及其抗腫瘤作用機制

溶瘤病毒是具有自我增殖能力的一類特異性腫瘤殺傷型病毒，其能夠在腫瘤細胞內自我復制并造成腫瘤細胞裂解，同時不影響正常細胞與組織。

溶瘤病毒的作用機制主要有兩類：第一類為病毒直接介導的細胞毒作用，溶瘤病毒可特異性感染腫瘤部位并自我增殖，在抑制腫瘤生長的同時擴增大量子代病毒裂解腫瘤細胞，從而直接殺傷腫瘤細胞。第二類為激活免疫系統，通過改變腫瘤微環境，增強腫瘤微環境的免疫原性，或釋放腫瘤相關抗原或炎癥因子等多種途徑，誘導自身免疫系統針對腫瘤細胞進行殺傷，解除腫瘤部位的免疫抑制狀態[8-9]。此外，溶瘤病毒也可以感染腫瘤部位血管，破壞腫瘤血管，抑制腫瘤獲取營養，從而殺死腫瘤細胞[10]。

2 溶瘤病毒治療肝癌的研究進展

溶瘤病毒具有直接裂解腫瘤細胞、誘發并增強機體對腫瘤的特異性免疫應答、增強其他抗腫瘤藥物效果等多種作用，但不影響正常細胞生長，其特異性強、不良反應小，因此通過基因修飾或改造的溶瘤病毒在肝癌治療領域備受關注。目前用于肝癌治療的溶瘤病毒主要有腺病毒、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等[11]。

2.1 溶瘤腺病毒

目前全球已上市兩款腺病毒抗腫瘤藥物，且有20 多種腺病毒相關藥物處于臨床試驗階段。腺病毒的主鏈可進行靈活的基因修飾，由于其高度可定制性，腺病毒成為了最重要的溶瘤病毒之一，在腫瘤治療中常用的腺病毒為致病力弱的人血清2型或5 型腺病毒[12]。

ONYX-015 是一種5 型腺病毒，刪除了E1B-55KD 基因，使其能在抑癌基因p53 缺失細胞中優先復制[13]。在其Ⅱ期臨床試驗中，19 例肝膽惡性腫瘤患者接受了病灶內ONYX-015 治療，ONYX-015病灶內注射治療肝膽腫瘤患者安全且耐受性良好，部分患者有抗腫瘤作用證據。重組人5 型腺病毒H101 與ONYX-015 非常相似[14]，但在其E3 基因中有一個額外的缺失，刪除了E1B-55KD 和E3 部分基因片段，使其在精準溶瘤的同時實現全身免疫，是全球首個上市的溶瘤腺病毒抗腫瘤藥物。重組人5 型腺病毒H101 可選擇性感染p53 功能缺失的腫瘤細胞，而正常細胞不受影響，在一定劑量范圍內對p53 功能缺失的肝癌細胞具有抗腫瘤活性。體外研究表明，重組人5 型腺病毒H101 對HepG2細胞有顯著抑制增殖作用。在不能切除的肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中，經導管動脈栓塞化療（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）聯合重組人5 型腺病毒H101 治療與單獨采用TACE 治療相比，改善了總生存率、無進展生存期和完全緩解率。臨床治療中顯示，重組人5 型腺病毒H101 聯合TACE 治療可使腫瘤降期，從而達到手術切除的目的[15]。針對TACE 治療后部分耐缺氧及化療耐藥的腫瘤細胞，為預防HCC復發，Zhang 等[16]構建了一種缺氧復制型溶瘤腺病毒，克服栓塞后缺氧的腫瘤微環境，可特異性地靶向存活的肝癌細胞。

2.2 HSV

HSV 是嗜神經性的雙鏈DNA 包膜病毒，可分為Ⅰ型HSV（HSV-1）和Ⅱ型HSV（HSV-2）兩種血清型。HSV-1 具有宿主范圍廣泛、能夠攜帶多種外源DNA 等優勢，因此目前處于臨床試驗的溶瘤HSV 大部分由HSV-1 改造而來。

在美國獲批的第二代溶瘤HSV-1 T-VEC[17]便是由HSV-1 改造而來的，敲除了c34.5 和a47 基因后將人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子基因插入缺失的c34.5 位點。一項T-VEC 與帕博利珠單抗（pembrolizumab）的Ⅰb/Ⅱ期臨床試驗目前正在進行中，Ⅰb 期主要研究T-VEC 單藥肝內注射治療HCC 以及T-VEC 與帕博利珠單抗全身靜脈給藥聯合治療肝轉移的安全性，Ⅱ期主要研究T-VEC 與帕博利珠單抗聯合給藥治療晚期實體瘤的安全性及有效性（NCT02509507）。第三代溶瘤HSV-1 T-01[18]在第二代溶瘤HSV 的基礎上繼續改進，刪除了病毒蛋白感染細胞多肽6（infected cell polypeptides 6，ICP6），由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）基因取代ICP6 基因，因此也比兩個突變的病毒（如T-VEC）更安全。T-01 可抑制人肝癌細胞系和肝母細胞瘤細胞系腫瘤的生長，結果表明第三代溶瘤HSV-1 可作為HCC 患者的新型治療方法?；谶@些進展，設計了一種基于HSV-1 的溶瘤載體Ld0-GFP[19]，該載體來源于溶瘤ICP0 缺失病毒（d0-GFP），具有融合表型，是一種針對HCC 以及其他類型腫瘤細胞的新型殺手。與d0-GFP 相比，Ld0-GFP 在體內外均表現出優越的腫瘤細胞殺傷能力，靶向廣譜HCC 細胞，具有更好的安全性。

2.3 溶瘤牛痘病毒

Pexa-Vec（JX-594）是一種具備復制能力、轉基因表達的免疫治療性溶瘤牛痘病毒，可破壞病毒胸苷激酶基因，并表達人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和β-半乳糖苷酶基因[20]。Ⅰ期臨床試驗表明，JX-594 治療原發性或轉移性肝癌具有良好的耐受性。在JX-594 復制、粒細胞-巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）表達和全身播散的背景下，其安全性可接受，并對幾種難治性腫瘤具有抗腫瘤作用[21]。在隨機的Ⅱb 期臨床試驗中，研究索拉非尼治療失敗后接受JX-594 治療的療效和安全性。研究存在顯著的局限性，接受JX-594 治療的患者總生存率沒有改善。然而，研究也取得了一些成果，通過β-半乳糖苷酶的測量確認了病毒復制，并通過酶聯免疫斑點試驗檢測了T 細胞對腫瘤特異性抗原[如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、黑色素瘤相關抗原（melanoma antigen gene，MAGE）-A1/A3/A4]生存素的應答[22]。PHOCUS 是一項Ⅲ期臨床試驗（NCT02562755），對比研究了在既往未接受過全身治療的晚期HCC 患者中，采用Pexa-Vec 加索拉非尼聯合用藥和索拉非尼單藥治療的療效，但在進行中期分析后，結果顯示臨床試驗不太可能達到主要終點，因此終止了該臨床試驗[23]。

3 溶瘤病毒聯合其他治療手段治療肝癌的研究進展

盡管一些溶瘤病毒治療腫瘤的臨床前研究得到極大的關注，但在臨床試驗中，溶瘤病毒的治療效果往往達不到基于臨床前模型的預期療效，但與其他治療手段聯用時表現出了很強的應用潛力，因此通過其他治療手段與溶瘤病毒聯合使用或許可能是優化其殺傷腫瘤細胞作用的有效策略。

3.1 溶瘤病毒聯合化療藥物治療肝癌

Xiao 等[24]在之前構建的重組腺病毒CD55-TRAIL-IETD-MnSOD（CD55-TMn）的基礎上，進一步研究發現CD55-TMn 與多柔比星聯合使用可以通過協同作用增強CD55-TMn 在體外和體內的抗腫瘤作用。一項臨床研究也顯示，對于晚期肝癌患者，在化療基礎上聯合H101 瘤內注射可提高客觀有效率和生存率，且耐受性良好[25]。

3.2 溶瘤病毒聯合免疫檢查點抑制劑治療肝癌

治療腫瘤的方法之一是使用針對免疫檢查點蛋白的抑制劑，如程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）和細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）。

王立朋等[26]將PD-1 抗體的重鏈和輕鏈插入流感病毒PR8 的聚合酶堿性蛋白1（polymerase basic protein 1，PB1）基因片段和聚合酶酸性蛋白（polymerase acid protein，PA）基因片段中得到重組流感病毒株rFlu-aPD1，體內外實驗顯示具有良好的靶向殺傷肝癌細胞的效果。在另一項研究中，將CTLA4 插入流感病毒PR8 中得到rFlu-CTLA4，在皮下小鼠肝癌模型中，與注射PR8 病毒相比，瘤內注射rFlu-CTLA4 可抑制腫瘤的生長，延長了小鼠的總生存期[27]。這些結果激發了進一步探索這種溶瘤病毒聯合免疫檢查點抑制劑的潛在用途。一項關于重組人5 型腺病毒和PD-1 抗體聯合治療的研究結果顯示，2 例患者在經射頻消融預處理后聯合重組人5型腺病毒和PD-1治療獲得了完全緩解，是治療晚期HCC 的有效方法[28]。一項T-VEC 與帕博利珠單抗的Ⅰb 期臨床試驗結果也顯示，肝內注射T-VEC 聯合靜脈注射帕博利珠單抗治療肝癌或肝轉移患者是安全可行的[29]，值得進一步研究。

3.3 溶瘤病毒聯合靶向藥物治療肝癌

索拉非尼是一種口服多靶點多激酶抑制劑，具有雙重抗腫瘤作用，主要用于治療晚期肝癌以及晚期腎癌，但其單用療效有限且不良反應發生率高。李璐璐等[30]體外實驗研究發現，索拉非尼聯合重組人5 型腺病毒注射液H101 對HepG2 細胞的增殖抑制作用明顯優于單用索拉非尼，且在一定濃度范圍內兩藥聯用表現出協同作用。莊建發等[31]也對索拉非尼聯合重組人5 型腺病毒H101 用藥進行了研究，結果發現兩藥聯用抑制HepG2 細胞增殖的主要機制為對RAF/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號轉導通路起到阻斷作用，誘導腫瘤細胞凋亡，并有效抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，抑制腫瘤細胞增殖。VSVΔ51 是水皰性口炎病毒的新型突變體，一項研究發現，具有DNA-PK 抑制能力的小分子藥物M3814 可以顯著提高VSVΔ51 的溶瘤活性，在外周實體瘤模型中取得了強大的抗腫瘤效果[32]。這種增效作用是通過增強腫瘤細胞的內質網應激實現的，該研究或許可以為肝癌的治療提供一種新的思路。

3.4 溶瘤病毒協同過繼性細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）治療肝癌

ACT是一種將自體或異體具有免疫活性的細胞在體外進行擴增后再輸至患者體內的治療方法[33]，從而達到抑制和殺傷腫瘤細胞的目的。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cell，CIK）體外增殖能力強，安全性高，自身具有腫瘤殺傷能力，又不具備抗原呈遞能力。溶瘤病毒在治療實體瘤時采用靜脈注射的給藥方式往往會導致病毒被免疫系統清除，因此，應用CIK 細胞作為運載溶瘤病毒的載體，可以攜帶溶瘤病毒，高效感染腫瘤細胞，從而發揮CIK 細胞和病毒的聯合殺瘤作用。有研究表明，構建攜帶抗p21 Ras scFv 的重組溶瘤腺病毒KGHV500，并利用CIK 細胞遞送KGHV500，其抗腫瘤療效遠優于單獨使用CIK 細胞或KGHV500，開發了一種治療RAS 驅動的肝癌的新策略[34]。

4 小結及展望

溶瘤病毒具有在腫瘤細胞中選擇性復制并裂解腫瘤細胞的獨特能力，還能激活自身免疫系統，間接誘導旁觀者效應（包括破壞腫瘤血管）并增強腫瘤免疫治療。近年來，作為一種有潛力的抗腫瘤藥物，溶瘤病毒的研究取得了重要進展，但溶瘤病毒的應用仍存在一定的局限性。溶瘤病毒進入機體后易被清除，從而導致靶向腫瘤部位的抑癌病毒量不足，難以發揮出理想的抑癌作用；利用載體裝載病毒雖能提高溶瘤病毒的靶向性，但所用載體的安全性及有效性也需進一步研究；同時溶瘤病毒進入機體后，會產生較強的免疫應答，出現諸如發熱、流感樣癥狀等常見不良反應。因此，阻礙溶瘤病毒療法發展的主要因素是腫瘤微環境中的系統和物理屏障。針對溶瘤病毒療法的上述局限性及不良反應，如下問題亟須進一步研究解決：①降低病毒毒性，提高安全性，確保病毒能夠在不感染健康細胞的情況下最大限度地在腫瘤細胞中復制并裂解腫瘤細胞，盡量減少不良反應。②提高溶瘤病毒靶向腫瘤細胞的能力，構建安全有效的載體平臺，防止病毒被人體強大的免疫系統消滅，以提高治療效果。③溶瘤病毒注射的劑量較大，溶瘤病毒產品目前最大的技術難點在于如何大規模制備以實現批量生產應用。

綜上所述，由于溶瘤病毒的獨特作用機制，溶瘤病毒在大量的臨床前研究中展現出了抗腫瘤的顯著療效及安全性，具有良好的臨床應用前景。但是由于肝癌等實體瘤生物學特性更為復雜，臨床試驗中溶瘤病毒單藥治療肝癌的研究仍未取得突破性進展。溶瘤病毒聯合其他治療手段治療肝癌具有良好的發展前景，已有臨床試驗開始對聯合治療手段展開探索，且取得了不錯的結果，但目前仍未大范圍應用于臨床，因此需要更多、更大樣本量數據進行驗證。