hsa-miR-92a-3p靶基因預測及生物信息學分析

翁雪婷，陳 瑩，林 雙，廖溫靖，黃 婕，蔡藝煌

(1.廈門醫學院，福建 廈門 361023；2.口腔生物材料福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023)

MicroRNAs(miRNA)是長度約為22個堿基的內源性非編碼小RNA分子，可以通過靶向作用抑制或者降解靶mRNA的翻譯水平來調節特定靶基因的表達[1]。人類miR-92a(hsa-miR-92a)的編碼基因位于13號染色體的長臂上，屬于miR-25基因家族。越來越多的研究表明，has-miR-92a-3p參與到多種癌癥及疾病的發生發展過程中，如前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺部內皮細胞損傷和炎性反應[4]以及肺纖維化[5]、過度肥胖[6]、凝血功能障礙[7]等。hsa-miR-92a-3p 參與了多種人類疾病的發生發展過程，對hsa-miR-92a-3p 進行靶基因相關生物信息學分析，為今后進一步深入探索 hsa-miR-92a-3p 功能和作用具有十分重要的指導意義。本研究通過對miR-92a-3p的生物信息學預測分析，篩選出192個hsa-miR-92a-3p的靶基因，并通過構建靶基因集合編碼蛋白質間的相互關系網絡，獲取關鍵節點靶基因，為進一步深入探究hsa-miR-92a-3p相關分子功能及作為臨床診斷和檢測靶標提供理論研究基礎。

1 材料與方法

利用miRBase(http：//www.mirbase.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UCSC (http：//genome.ucsc.edu/)等在線數據庫查找miR-92a-3p的染色體定位、堿基序列、物種保守性等基礎信息。然后使用miRGator(http：//mirgator.kobic.re.kr/)查看miR-92a-3p在不同疾病中的表達豐富度。再通過miRDB(http：//mirdb.org/)、TargetScan(http：//www.targetscan.org/)、Clip-seq(http：//mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/)和miRWalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)四種在線軟件預測miR-92a-3p的靶基因。利用venny2.0在線軟件取交集，最終確定miR-92a-3p的靶基因集合范圍。利用在線數據庫string11.5(http：//string-db.org/)查詢獲得所預測靶基因集合編碼蛋白質之間的相互關系網絡，并將所得數據導入Cytoscape_3.9.0軟件進行蛋白質互作網絡圖的制作。

將前期韋恩圖集合交集得到的靶基因及其分析數據整理格式后導入在線數據庫DAVID[DAVID：Functional Annotation Result Summary (ncifcrf.gov)]對靶基因數據進行功能富集GO分析，得到的功能注釋相對于背景具有統計意義(P<0.05)。再使用KOBAS3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對4個數據庫預測的靶基因交集(共192個基因)進行KEGG信號轉導通路富集分析，以P<0.01作為差異有統計學意義的標準。

2 結果與分析

2.1miR-92a-3p 定位及序列保守性分析：通過在線檢索miRBase、UCSC數據庫，確定hsa-miR-92a-3p基因序列號為MIMAT0000092，位于13q31.3的染色體區域內(見圖1)，基因位點在 chr13：91 351 314～91 351 391。通過miRBase在線數據庫檢索miR-92a-3p的成熟序列，結果顯示，在33 個不同物種中存在高度保守的成熟序列。在對不同物種的miR-92a-3p序列進行比對分析，發現 miR-92a-3p 的成熟序列“UAUUGCACUUGUCCCGGCCU”在人、獼猴、小鼠、山羊、眼鏡王蛇、綠海膽等多物種之間具有高度的保守性(見表1)。

圖1 miR-92a-3p 在人類基因組中所處的位置

表1 不同物種miR-922-3p成熟序列

2.2hsa-miR-92a-3p在人類各組織的表達分析：利用miRGator 3.0在線數據庫查找miR-92a-3p在不同人體疾病中的表達情況，其中在乳腺頂漿分泌癌、乳腺癌、乳腺導管原位癌、乳腺化生、淋巴瘤、鼻咽腫瘤、牛皮癬、黑色素瘤中表達豐富(見圖2)。

圖2 miR-92a-3p 在人類基因組中所處的位置

2.3miR-92a-3p 的靶基因預測：通過TargetScan、miRDB、Clip -Seq、miRWalk 4種公共數據庫分別預測出了1 041、985、2 019、50 420個靶向調控基因，利用venny2.0取交集后最終確定192個預測交集靶基因，占各軟件預測到的靶基因總數的 1.3%(見圖3)。

圖3 miR-92a-3p的預測靶基因

2.4靶基因編碼蛋白質間的互相作用預測：將4個數據庫預測到的靶基因取交集后，將數據導入到String11.5公共數據庫在線分析靶基因編碼蛋白質間的相互關系，然后再把String11.5分析結果導入Cytoscape_v3.9.0軟件繪制PPI圖，結果顯示，miR-92a-3p的靶基因編碼蛋白質之間具有復雜的蛋白質互作關系，尤其是靶基因PTEN、ITPR1、MAPK8、FBXW7、KAT2B、SMAD7的編碼蛋白質在Cytoscape_v3.9.0中利用算法分析相關度高且在整個網絡中處于關鍵節點位置(見圖4)。

圖4 miR-92a-3p 預測靶基因所編碼蛋白質間的相互作用分析

2.5miR-92a-3p靶基因KEGG分析：對4個數據庫都預測到的192個靶基因進行KEGG信號轉導通路富集性分析，發現miR-92a-3p的靶基因顯著富集在PI3K-Akt signaling path way、FoxO signaling pathway、Cellular senescence等信號通路中(P<0.01，見表2)。

表2 miR-92a-3p預測靶基因的KEGG分析結果

2.6miR-92a-3p靶基因GO分析：對4個在線數據庫所預測到的192個靶基因進行GO功能富集分析，發現miR-92a-3p的靶基因顯著富集在細胞質、細胞核、核質、內質網等10個細胞組件(P<0.05)，參與細胞增殖、細胞分化、細胞周期蛋白質的合成等生物過程(P<0.05)(見圖5)。

圖5 miR-92a-3p 預測靶基因的GO功能注釋結果

3 討論

本研究通過對不同物種的has-miR-92a-3p的序列對比發現，序列 UAUUGCACUUGUCCCGGCCU 在16個物種中保持高度保守性，說明has-miR-92a-3p在進化過程中具備穩定性，保守性[8]，以此提示has-miR-92a-3p可能在參與機體正常生理和病理的生物學功能過程中發揮重要的作用。

本研究推測PTEN、MAPK8、KAT2B、ITPR1為此蛋白質互作網絡的中心節點蛋白質，因此我們推測這4個中心節點基因可能在has-miR-92a-3p調控的生物學效應中發揮著重要的作用。進一步對這些中心節點基因進行生物學功能分析，發現中心節點基因所參與的分子生物功能過程包括轉移酶的合成、細胞周期、生物節律、配體結合、細胞凋亡、核苷酸合成過程等。大量研究發現has-miR-92a-3p在多種腫瘤中異常表達，表明其在腫瘤的發生發展過程中發揮的重要的作用。has-miR-92a-3p在乳腺癌[9]、胃癌[10]和食道癌[11]中表達上調，從而促進了癌細胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究表明，has-miR-92a-3p在前列腺癌中被IncRNA FER1L4結合，從而上調FBXW7，抑制前列腺癌細胞的增殖和存活[12]。has-miR-92a-3p還被證實可通過作用PTEN而調節其下游PTEN/AKT通道來促進癌細胞轉移和上皮間充質轉化[13]。

近年來，許多研究發現has-miR-92a-3p能夠通過PI3K-Akt信號通路影響腫瘤發生發展。楊檳伊研究[14]表明has-miR-92a-3p可以通過將PTEN作為靶目標調節其表達，進而調控PI3K-Akt信號通路來促進神經母細胞瘤的增殖、浸潤和轉移等的惡性發展；劉宇等對比正常胰腺導管上皮細胞和胰腺癌細胞發現，has-miR-92a-3p通過靶向抑制PTEN的表達，進而促進胰腺癌細胞的增殖和遷移[15]；Hang等人揭示has-miR-92a-3p可以靶向調控CDH1和Notch-1影響β-catenin和Akt信號通路，進而在膠質瘤發生發展中有著重要作用，并通過體外下調has-miR-92a-3p證實其下調可抑制膠質瘤細胞惡性腫瘤[16]。特別是Yang等通過對高轉移肝癌細胞進行外泌體測序，確定has-miR-92a-3p是肝癌進展的潛在標志物，并發現has-miR-92a-3p能夠抑制PTEN激活Akt/Snail信號通路，促進受體癌細胞EMT和肝細胞癌的轉移[13]。揭示has-miR-92a-3p可以作為惡性腫瘤發生發展過程中潛在的生物標志物，未來有望應用于臨床早期診斷和預后判斷。

綜上所述，本研究采用生物信息學數據庫方法獲取了hsa-miR-92a-3p在部分疾病中通過靶基因調控疾病發生發展的生物學功能、基本序列信息、靶向調控基因、靶基因編碼蛋白質的相互關系網絡圖、GO 分析和 KEGG 信號通路分析等的結果，為探究hsa-miR-92a-3p在腫瘤中潛在的分子調控機制提供理論依據，然而本文章預測結果也有待實驗的研究來進一步證實。