葛根素對牙周炎大鼠Th17/Treg 細胞免疫平衡及相關轉錄因子表達的影響

詹樂，馬瑞堉，萬妮，莫禮文，陳薈穎，張黎

（1）海南醫學院口腔醫學院，海南 海口 570102;2）蘭州大學口腔醫學院，甘肅 蘭州 730000）

牙周炎已發展成為人類最普遍的慢性感染性的口腔疾病之一[1]。相關調查與研究表明，成人牙周炎發病率約達70%，一旦治療不及時，會引起牙槽骨不可逆性損傷，最后導致牙齒松動，這也是成年人失牙的最主要原因[2]。牙周病的病因很復雜，其具體的發生機制目前還不清楚。

目前研究指出，在牙周病的病理破壞過程中，牙周病的始動因子為牙菌斑生物膜，宿主免疫的過度炎癥反應通常是加重牙周軟硬組織破壞的主要損害因素[3]。有關學者提出有關于調控宿主防御反應方法，被稱為宿主免疫調節治療（host modulatory therapies，HMT），通過研究抑制牙周組織的不可逆性的損傷破壞[4]。在常規牙周防治手段的基礎上，輔助應用宿主免疫調節藥物以達到理想的防治效果。其中主要以六位地黃丸為研究基礎的固齒膏及固齒丸等[5-6]。近年研究表明，一些植物中藥提取物常常可以輔助治療牙周病，例如：姜黃素、白藜蘆醇等。葛根素（Puerarin）屬于異黃酮類，也是防治牙周病的有效成分。有相關動物實驗研究初步證實，葛根素具有抗炎、抑制相關基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）、骨保護等生物活性功能，同時有較高的相關生物的安全性，是對牙周炎宿主調節治療的最有效藥劑之一[7]。Wang等[8]研究表明輔助性 T細胞17（Th17）、調節性 T 細胞（Treg）之間比值失衡所導致的自身免疫反應，會引起牙周組織病理發病機制。目前，在牙周病的發展過程中，葛根素藥物通過調節Th17/Treg 細胞免疫平衡，以減少牙周組織病理性破壞的主要機制還需要進一步證實。本實驗采用牙周炎大鼠，并給予200 mg/（kg·d）葛根素液灌胃處理，以進一步去觀察葛根素液對牙周炎大鼠Th17/Treg 細胞免疫狀態平衡的影響，為開發慢性牙周炎藥物提供新的分子靶點，同時為治療慢性牙周炎提供新的方法和理論依據，揭示葛根素老藥新用的臨床轉化價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物上海斯萊克實驗室提供實驗動物，SPF 級Sprague-Dawley（SD）大鼠，8 周齡，雄性，體重（260 ± 20）g，許可證號：SCXK（蘇）2019-0005，實驗動物房，許可證號：SYXK（浙）2020-0015 。本研究經浙江杭州赫貝科技有限公司實驗動物倫理委員會審批（審批號：HB2010037）。

1.1.2 主要試劑及儀器葛根素注射液（國藥準字H20033292，規格 2 mL∶100 mg，生產批號：20 060 472）山東華信制藥集團股份有限公司；PE anti-rat CD25 Antibody、Foxp3 Antibody、IL-17A Monoclonal Antibody、PE-Cyanine7、Fixation/Permeabilization 和 Permeabili-zation Buffer（eBioscience，USA）；其他試劑均為國產分析純。MicroCT設備（瑞 士 SCANCO Medical AG，μCT100）。微量加樣儀（Thermo 公司）；高速冷凍離心泵（H1650R，上海盧湘儀）；流式細胞儀（Accuri C6，BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 牙周炎大鼠建模、實驗分組Sprague-Dawley（SD）大鼠36只，SPF級，雄性，8 周齡，體重為（260 ± 20）g，無牙周疾病，健康狀況良好。試驗前在動物實驗房環境中適應1 周。聚丙烯的合成塑料大鼠小籠分籠飼養，溫度（24 ± 2）℃，相對濕度為40%～60%，明暗周期12 h/12 h。自由飲水、飲食，清潔飼料的環境。隨機分為3 組：正常對照組（A組）、牙周炎模型組（B組）、葛根素組（C組），每組各12只，A 組不做任何處理，B 組和C 組大鼠雙側上頜第1 磨牙頰舌側正中牙齦下，注入含20 g/L 的大腸桿菌內毒素（ELPS）的生理鹽水50 μL，注入藥物前1 d 絲線結扎，每間隔48 h 牙齦下注射1 次E-LPS，共注射4次，A 組則每次在同一部位注入等量的生理鹽水。在術后每天仔細觀察大鼠牙周狀況，通過檢查牙齦形態、菌斑指數、探診出血狀況、探診牙周袋的深度，還有牙槽骨的吸收情況，從而判斷口腔衛生情況、牙齦情況及牙周情況。第4 周牙周炎模型構建完成后，C 組按照葛根素液200 mg/（kg·d）灌胃給藥，B 組、C 組進行等量生理鹽水灌胃，均連續灌胃14 d。

1.2.2 牙槽骨吸收情況評估用頸椎脫臼法處死大鼠后，取上頜骨，并去除不符合實驗標準的軟組織，再用4%多聚甲醛固定24 h后，再進行顯微 CT 掃描檢查，并用 NRecon 軟件進行三維重建。牙槽骨吸收的標準主要從以下兩個方面判斷：（1）定性分析：選擇大鼠雙側上頜第一磨牙頰側及舌側的近中、中間、遠中共6 個位置，測量從釉牙骨質界（cementoenamel junction，CEJ）至牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的垂直度間距（CEJ-ABC）；（2）定量分析：通過對比不同組大鼠牙槽骨骨小梁厚度（trabecular thickness）、骨小梁分離度（trabecular separation）、骨小梁數量（trabecular number）骨體積分數（BV/TV）、骨礦化密度（bone mineral density，BMD）等骨骼生物參數，定量分析牙槽骨吸收狀況。

1.2.3 HE 染色觀察大鼠牙周組織變化情況各組隨機選擇3 只大鼠，用頸椎脫臼法處死大鼠后，再收集上頜骨組織，4%甲醛溶液固定，3～5 d后取出組織，修整所需厚度及形態，將組織經過不同濃度乙醇脫水加工處理，石蠟包埋組織，待蠟塊冷卻后放置-20 ℃溫度冷凍，制作切片，厚度5 μm，65 ℃的恒溫箱儲存6～12 h，HE 試劑盒對標本染色，HE 染色觀察牙周組織及骨組織的再生。

1.2.4 流式細胞術檢測全血細胞中 Th17 和 Treg細胞比例分布的變化情況取各組大鼠抗凝全血，離心5 min后，細胞沉淀，洗滌后、計數重懸。將100 μL 的細胞懸液放置于EP管，依次同時加5 μL 的CD4，FITC 和5 μL IL-17、5 μL CD25，PECyanine7；避蔭孵育，離心棄上清液；用500 μL的Flow Cytometry staining buffer 重懸細胞，均勻后上機測定CD4+IL-17+細胞比例、CD4 +CD25+Foxp3+細胞所占的淋巴細胞比例。采用Accur C6 軟件解析，以 IL-17 染色表示Th17、Foxp3 染色表示Treg，分析2 種細胞變化的情況。

1.2.5 免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠牙周組織中 IL-10、IL-17、RORγt 和 Foxp3 蛋白的表達情況取0.1 mg 牙周組織，加入500 μL 裂解液，準備出所需蛋白樣，蛋白濃度值采用BCA 方法測定，制膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳，預先配置1 L 轉移緩沖液并冷卻至4 ℃，制成PVDF 轉膜，孵育所需抗體，緩沖液洗膜后，再加入ECL 的化學發光顯影劑附著在膜的表面，再置入凝膠圖像分析儀中，以化學光敏模式曝光顯影。

1.3 統計學處理

應用SPSS22.0 軟件，對統計數據進行綜合分析，計量資料以（）表示，組間對比采用單因素方差分析，兩兩對比采用q檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 葛根素對大鼠牙槽骨吸收的影響

與牙周炎模型組對比，其他2 組大鼠牙槽骨礦物質密度、骨質量和硬度均明顯升高，牙周炎大鼠經葛根素干預處理治療后，骨體積分數減少。模型組與對照組相比BV/TV 數值下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；葛根素治療組與模型組對比，BMD 數值升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組Micro-CT 掃描重建圖Fig.1 Micro-CT scan reconstruction for each group

表1 各組Micro-CT 掃描分析后骨體積分數、骨礦物質密度值（n=12，）Tab.1 BV/TV and BMD values of each group obtained by micro-CT scan analysis（n=12，）

表1 各組Micro-CT 掃描分析后骨體積分數、骨礦物質密度值（n=12，）Tab.1 BV/TV and BMD values of each group obtained by micro-CT scan analysis（n=12，）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

2.2 葛根素對牙周組織病理形態學的影響

對照組的牙周膜可見微量炎癥細胞聚集，牙槽骨結構正常。模型組的牙周膜可見大量炎癥細胞聚集，牙槽骨被炎癥細胞破壞。葛根素組的牙根部可見明顯新生骨細胞增生，牙周膜可見少量炎癥細胞聚集，牙槽骨結構較整齊，見圖2。

圖2 HE 染色觀察牙周組織形態學特征變化（×100）Fig.2 Observation of histomorphological changes in periodontal tissue by HE staining（×100）

2.3 葛根素對全血中Th17/Treg 細胞比例的影響

與對照組比較，模型組的TH17、Treg 細胞比例均升高，且TH17/Treg 的細胞比例也呈顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，葛根素組的TH17、Treg 細胞比例均下降，且TH17/Treg 的細胞比例也是下降的，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3～圖7。

圖3 全血細胞中TH17 細胞比例Fig.3 Percentage of Th17 cells in whole blood

圖4 全血細胞中Treg 細胞比例Fig.4 Percentage of Treg cells in whole blood

圖5 全血細胞中Th17/Treg 細胞比例Fig.5 Th17/Treg cell ratio in whole blood

圖6 流式細胞術檢測全血細胞中各組Th17 細胞比例變化Fig.6 Change in the proportion of Th17 cells in whole blood detected by flow cytometry

圖7 流式細胞術檢測全血細胞中各組Treg 細胞比例變化Fig.7 Change in the proportion of Treg cells in whole blood detected by flow cytometry

2.4 葛根素對牙周組織中IL-10、IL-17、RORγt和 Foxp3 蛋白的表達影響

IL-10、Foxp3：與對照組相比，模型組蛋白的表達量有所減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，葛根素組蛋白表達量明顯上調，有差異（P＜0.05）。IL-17、RORγt ：與對照組相比，模型組蛋白表達量明顯上調，有差異性（P＜0.01）；與模型組相比，葛根素組的蛋白量呈明顯下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖8～圖12。

圖8 WB 檢測 IL-17、RORγt、IL-10、Foxp3 蛋白表達Fig.8 Western blot detection of IL-17，RORγt，IL-10，and Foxp3 protein expression

圖9 各組牙周組織中IL-10 蛋白表達分析圖Fig.9 Analysis of IL-10 protein expression in periodontal tissues

圖10 各組牙周組織中IL-17 蛋白表達分析圖Fig.10 Analysis of IL-17 protein expression in periodontal tissues

圖11 各組牙周組織中Foxp3 蛋白表達分析圖Fig.11 Analysis of Foxp3 protein expression in periodontal tissues

圖12 各組牙周組織中RORγt 蛋白表達分析圖Fig.12 Analysis of RORγt protein expression in periodontal tissues

3 討論

牙周病的基本病理進程中，典型的臨床表現是牙齦組織血管炎癥性充血、牙周袋產生、牙槽骨吸收和牙齒松動等，是一種牙周組織破壞性病變[9-10]。研究結果顯示在建立大鼠牙周炎模型過程中，大鼠牙周組織炎癥有一定的自愈性，這可能與大鼠自身宿主免疫反應有關，病理檢測發現大鼠牙周炎與人體牙周炎表現極為相似[11]。本次實驗通過對大鼠雙側上頜第1 磨牙牙頸部結扎，結合大腸桿菌內毒素（E-LPS）齦下注射的方式，成功構建了實驗性大鼠牙周炎模型，在術后第4周，牙周炎模型組和葛根素組大鼠均出現牙齒牙齦紅腫，探診出血明顯，頰側探診深度至1～2 mm，而對照組大鼠牙周相關檢查均無明顯異常。MicroCT 定量及定性分析模型成功后，對葛根素組連續給藥14 d后，牙槽骨高度測定結果表明，牙周炎組6 個位點測定值均顯著超過對照組和葛根素組，提示在牙周炎組的牙槽骨周圍發生了明顯炎癥吸收。以上結果表明，分離牙齒游離齦，用絲線結扎的第1 磨牙牙頸部，結合大腸桿菌內毒素（E-LPS）在齦下注射4 周可誘導形成實驗性的牙周炎大鼠模型，葛根素對大鼠牙周炎牙槽骨吸收作用可能產生了相應的抑制效果。

葛根素（Puerarin）亦名葛根黃酮，其功能有降血糖、降低膽固醇、抗感染、保護血管、抗氧化應激等，不良反應較小，故稱為"植物雌激素"[12]。已有研究證實葛根素具有抗炎活性且具有較高的生物安全性，異黃酮是調節抗炎作用的主要活性成分[6]。吳琳琳等[13]發現葛根素在適宜的含量濃度影響下，可有效促使人牙周膜干細胞（hPDLSCs）向成骨細胞分化，為在口腔中有效防治牙槽骨吸收所引起的牙周病提供有關理論依據。上述研究均證實了葛根素可以有效控制牙槽骨吸收，而且在本次研究中發現，與牙周炎模型組對比，葛根素組CEJ 到ABC 距離的減小，經葛根素處理治療后骨體積分數有所減少，且病理學檢測也顯示，葛根素組牙槽骨炎癥細胞浸潤情況對比其他2 組均相對較少，以上結果表明葛根素可減輕或終止大鼠牙周組織的破壞，但對于具體影響機制，目前尚不明確，本研究初步探索葛根素對牙周炎大鼠Th17/ Treg 細胞免疫平衡的相關影響。

近期科學研究證實，Th17、Treg 細胞之間比例的失調，與牙周炎的發生密切相關[14]。研究發現CD4 陽性T 細胞的2 種亞類：Treg 細胞和Th17 細胞，前者產生IL-10 和TGF-β，主要控制相關免疫反應；后者主要分泌IL-17，IL-17 為最早參加抗感染的免疫效應細胞，在人類固有免疫中起關鍵作用[15]。據有關科學研究證實，Th17細胞可誘導炎癥的產生與傳播，而Treg 細胞則可以維持自身耐受性，進而控制自身免疫[16]。現今，Th17 細胞與Treg 細胞的免疫平衡狀態通常是診斷治療相關自身免疫病變的關鍵性靶點。Th17 常常以釋放促炎因子IL-17 為其主要的特點，有STAT 依賴的特異性的轉錄因子維甲酸相關孤核受 體（retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt ）的加入參與，啟動了其受體生長增殖與分化過程，有獨特的調控機制，誘導RORγt 蛋白表達并促進了Th17 細胞分化[17]。2008年，Cardoso等[18]應用免疫熒光法，雙標定位CD4 和IL-17，第一次發現并證實了牙周炎患者牙周組織中存在大量Th17 細胞。Mistry等[19]研究表明，經過治療的牙周炎病人齦溝液中IL-17 的濃度含量已顯著減少，因此IL-17 可用作評價防治牙周炎有效性的重要指標。Glowczy等[20]通過減少Th17 細胞的含量，從而減弱宿主免疫炎性反應和骨破壞作用。本次實驗研究通過測定每組12 只大鼠，觀察全血中Th17 細胞比例的變化，檢測結果顯示牙周炎模型組對比葛根素組，Th17 細胞比例顯著升高，而且，轉錄因子RORγt 同分泌因子 IL-17 的蛋白表達量也升高，經過葛根素治療干擾之后，其結果相反，說明在牙周炎病理進展中，Th17 細胞分化產生RORγt、IL-17，進一步加劇了牙周組織炎癥反應，同時也提示葛根素可調控Th17 細胞減緩牙周組織的炎性反應。

調節性T 細胞是一類CD4+Foxp3+T 細胞亞群，擁有調控其他白細胞數量的特殊功能[21]。Treg 細胞可以通過控制自身免疫、調控免疫應答來減少有關炎癥性的反應，其特異性轉錄因子：Foxp3，主要分泌因子：IL-10。在牙周炎的病理變化過程中，Treg 細胞數量顯著增加，能更有效起到對宿主防護的效果。Parachuru等[22]研究也證實，對比牙周炎模型組，健康對照組中Foxp3、IL-10 蛋白表達量高，說明Treg 細胞及其相關因子Foxp3、IL-10，可調控牙周炎的產生。Nakajima等[23]研究表明在牙周炎中，對比觀察牙齦炎、健康對照組，Foxp3、TGF-β 以及IL-10 的表達量明顯增高。Kei等[24]的研究結果表明，在牙周炎小鼠齦下局部注入煙草提取物質后，在牙周組織中，Treg 細胞活力大幅下降且Foxp3、IL-10 表達水平也明顯降低，而與此相反，Th17 細胞活力、RORγt 和IL-17 蛋白表達水平則大幅度增高，因此小鼠的牙周組織炎性反應增加，常常伴隨著牙槽骨吸收的增加。本次實驗結果表明，與對照組相比，牙周炎模型組的Th17 細胞與Treg 細胞值均升高，Th17/Treg 細胞的比例也顯著增高，而葛根素組Th17 細胞和Treg 細胞值均下降，Th17/Treg細胞的比例也處于持續降低，這提示葛根素治療干預之后，牙周炎引起的相關免疫系統反應可選擇性地去重新招募Treg 細胞，從而進一步有效抑制牙周組織炎癥反應。進一步分析葛根素干預后的牙周炎大鼠，其全血中Th17 細胞表達量明顯減少，而Treg 細胞表達量顯著增加，同時Th17/Treg 細胞比值也明顯下降，說明葛根素干預治療后牙周宿主免疫反應在向著促進牙周組織愈合的有利方向發展，通過控制Th17/Treg 細胞表達量來緩解牙周組織的炎癥性反應。

綜上所述，菌斑微生物常常是口腔牙周炎的始動因子，而宿主免疫反應正是造成牙周組織損害的最重要的因素。如果牙周組織中炎癥持續存在，免疫細胞活躍，參與炎癥反應過程中發揮雙重作用，有利方面是吞噬病原菌，阻止細菌入侵;不利于牙周組織愈合方面是免疫細胞分泌各種細胞因子，最終導致牙周支持組織的損傷甚至喪失[25-27]。此次研究結果提示葛根素可以調節實驗性大鼠牙周炎Th17/Treg 細胞表達量，進而影響相關因子表達，使Th17/Treg 細胞及相關因子向有利于牙周組織愈合方向發展，降低相關炎癥因子的表達，從而減少牙周組織炎癥水腫反應及牙周組織破壞。但是，葛根素對牙周炎大鼠具體作用機制仍需要進一步研究探討。