肝纖維化病因與機制研究進展

何迪，陳鵬，劉鋒，徐楊，韓磊，丁文靜

（1）昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科，云南 昆明 650101;2）保山中醫藥高等專科學校臨床醫學院，云南 保山 678000）

肝臟是人體較為重要的臟器之一，其功能主要包括機體的代謝、分泌、合成、生物轉換和排泄膽汁等等，較為復雜的功能致使各種外源性和內在的因素可以引起肝臟功能異常，甚至發生病變。正常情況下，肝臟可以調節肝臟細胞的外基質平衡，而遺傳性疾病、酗酒、酒精性疾病、慢性病毒性肝炎、寄生蟲感染和一些不明原因引起的慢性肝損傷會引起正常肝細胞死亡，繼而會引起肝組織調節功能失調；當多種細胞出現外基質沉淀過多就會發展成肝臟纖維化，肝纖維化在沒有及時干預的情況下將進展為不可逆的肝硬化，甚至轉變成肝癌[1]。

一切慢性肝病的發生、轉變都有肝纖維化反應的參與，過度的肝纖維化反應會改變免疫系統、組織修復相關途徑與細胞外間隙的細胞間通訊。所有引起肝組織慢性損傷的因素，都可以激活多種細胞與通路引起肝組織的修復反應，這種修復反應將引起細胞外基質（extracellular matrix，ECM）等纖維化成分沉積在Disse 間隙，來包裹并隔離修復組織的受損部分[2]。正常情況下，組成肝臟Disse 間隙中ECM 的重要物質包括可以合成硫酸乙酰肝素和IV 型膠原（非纖維化）的蛋白多糖、糖蛋白的纖維連接蛋白和層粘連蛋白[2]。靜止狀態的肝星狀細胞在肝Disse 間隙中起到調節外基質平衡的作用，當損傷修復反應發生時，多種細胞因子和趨化因子作用于靜止的肝星狀細胞而被激活，從而產出大量ECM；此時非纖維化的IV 型膠原逐漸被纖維化I 型和Ⅲ型膠原纖維代替，透明質酸和α-平滑肌肌動蛋白也發生沉淀現象，隨著異常物質蓄積在肝組織中，肝臟的硬度增加，彈性減弱，繼而發生肝組織纖維化[2]。進而血管的收縮舒張受限，將導致門脈高壓的發生。導致肝組織損傷的因素如果沒有根除，肝纖維化就會加劇變化。大量實驗表明在前期去除損傷因素的情況下小鼠肝纖維化的進程停止，且表現出纖維化減退，表明肝纖維化是可逆的；因此在肝纖維化進一步發展成為不可逆的病變之前及時干預是非常有必要且意義重大的。在探究肝纖維化的治療中，了解肝纖維化的病因和機制則尤為重要。

1 導致肝臟纖維化的病因

肝組織纖維化實則是肝內的慢性損傷修復反應，因此可以導致肝組織損傷的因素都會引起肝纖維化反應，而引起肝組織損傷的常見因素在臨床中主要有遺傳性疾病、酗酒、酒精性疾病、慢性病毒性肝炎、寄生蟲感染和其他不明原因的肝損傷。

1.1 遺傳相關因素導致肝臟容易發生肝纖維化

如表1 所示，遺傳性基因變異導致肝組織損傷，隨后會產生肝纖維化甚至肝硬化、肝癌，是引起兒童肝組織纖維化或者硬化的首要原因，但不包括兒童肥胖因素[3]。隨著當代分子遺傳學與醫學科技的發展，遺傳性肝纖維化的病因被一一解釋。但是針對以上疾病的有效治療方案還沒有完善。以上基因突變中，在任何時期都可能發生的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）其主要易感因素是在肝細胞、脂肪細胞以及肝星狀細胞中大量表達并且編碼Patatin 樣磷脂酶結構域蛋白3 或脂聯素的PNPLA3 基因的突變[4]。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）儲存大量的維甲酸，可以激活視黃酸受體介導的轉錄，然后控制纖維化反應的產生。PNPLA3 基因已被證明具有視黃酸酯酶活性和三酰甘油脂肪酶活性，突變后會改變視黃酯酶活性，降低HSC 中維甲酸的含量，從而影響HSC 對肝纖維化的控制[5-7]。另外，PNPLA3 在肝細胞中的作用仍然具有爭議，因為其作用是雙面的。遺傳性基因突變的影響機制較為復雜，對兒童生活與生命影響很大，需要進一步加深研究。

表1 遺傳相關因素導致肝纖維化Tab.1 Liver fibrosis due to genetically related factors

1.2 酒精和藥物性肝損傷

肝臟是乙醇和藥物最主要的代謝場所，藥物性肝病相對不常見，主要發生在一些藥物的副作用或者某些中草藥治療中，一旦出現，如果不及時干預，將引起其他比較嚴重的臨床癥狀，甚至有生命危險。長時間大量攝入乙醇的人，肝臟的正常代謝將被打亂，引起一系列肝臟疾病，其中最常見的是脂肪肝、肝纖維化、肝硬化。肝臟中有3 種酶參與代謝乙醇為乙醛，分別是醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、醇誘導型肝細胞色素P450 CYP2E1（又稱微粒體乙醇氧化系統，MEOS）和過氧化物酶體過氧化氫酶。在乙醇代謝中會產生大量的NADH，NADH 會抑制糖異生過程中的乳酸轉化為丙酮酸的步驟，導致乳酸蓄積性酸中毒（酒精性酮癥酸中毒）和糖異生被抑制產生的低血糖癥狀[3]。乙醛是可以參與修飾肝組織中很多蛋白質和酶的，長時間大量攝入乙醇將導致乙醇的代謝過程中乙醛在肝組織蓄積，下一步引起肝細胞的功能問題，引起肝細胞受損死亡[3]。長期的肝細胞受損死亡將導致肝纖維化，肝硬化的發生。可以看出，控制乙醇的攝入是非常有必要的，特別是肥胖、病毒性肝炎等有基礎肝病的患者。

1.3 膽汁淤積

膽汁淤積的原因大致可以分為3類，先天性的膽道閉鎖、肝細胞膽汁分泌異常和膽道阻塞（寄生蟲、腫瘤或者結石）。這其中由原發性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）和原發性膽管炎（primary cholangitis，PBC）引起的慢性膽汁淤積最為常見。膽汁酸在慢性膽汁淤積后導致肝細胞損傷，進而發生炎癥反應，下一步可以激活HSC，長時間的淤積將導致肝臟纖維化發生[8]。同時引起PSC 和PBC 的病因也被認為與炎癥反應和自身免疫因素相關，可以看出炎癥反應在膽汁淤積致肝纖維化中起重要作用[9]。至今，對膽汁淤積導致肝纖維化的機制仍存在爭議，還需要進一步研究。

1.4 病毒性肝炎

由甲型、乙型等病毒引起的慢性肝炎導致的早期肝損傷、肝纖維化已被證實通過抗病毒或者免疫相關治療是可以被治療甚至逆轉的。病毒性肝炎在我國的總體感染率依然較高，但是隨著我國對嬰幼兒乙型肝炎病毒疫苗接種的重視，在非成人中的病毒性肝炎感染率顯著降低。肝纖維化是病毒性肝炎發展成為肝硬化和肝癌的初期中心階段，因此，病毒性肝炎的診療重點是消滅病毒阻止其發展成為肝硬化或肝癌。

病毒性肝炎引起肝纖維化的機制主要是病毒性肝炎引起的肝細胞損傷、死亡和凋亡引起的炎癥反應。早期炎癥反應起到保護作用，長時間的炎癥刺激將巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞過度激活，作用于肝組織的星狀細胞，并分泌促炎因子TGF-β、內皮生長因子和血小板衍生生長因子等繼續促使炎癥反應發生，另外也會作用于肝星狀細胞使其過度激活成為肌成纖維細胞并且分泌大量的平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維等非可溶性細胞外基質，最終將引起肝纖維化，由此進展為肝硬化肝癌[10-12]。因此，對病毒性肝炎應該遵循早發現早治療的原則，來最大限度地減少病毒性肝炎引起肝硬化或肝癌的發生。

2 肝纖維化機制

2.1 肝星狀細胞

肝細胞與肝竇內皮細胞之間的空隙稱為肝竇間隙。在正常情況下，靜止的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）呈現星型形態位于Disse 空間，且細胞內富含脂滴與維生素A 的初級儲存形式及視黃酯[13]。在正常肝組織Disse 間隙內存在各種細胞因子與免疫細胞，而免疫細胞又分泌細胞因子與趨化因子，可以通過媒介管理細胞之間的關系，這樣就能改變細胞的基因表達，連帶著增值、激活和衰亡都能控制，并有助于產生促炎反應或肝臟保護反應[14]。當病毒性肝炎、酒精中毒、藥物等肝病對肝組織造成慢性損傷、肝細胞死亡和肝組織修復反應時，靜態HSC 激活細胞因子分泌在周圍肝巨噬細胞，肝竇內皮細胞，肝細胞，血小板，免疫細胞。纖維生長因子主要是生產和發布的血小板，如血小板源生長因子、轉化生長因子β1、表皮生長因子等。可導致HSC 活化[15-16]。

HSC 是肌成纖維細胞的重要轉變來源，而促使纖維化之后就能通過肝祖細胞和門脈成纖維細胞來轉換成肌成纖維細胞，促進膠原分泌[17]。肌成纖維細胞的主要功能是分泌細胞外基質，如平滑肌肌動蛋白、I 型和III 型膠原纖維、纖連蛋白、凝血酶敏感性蛋白-1 和蛋白多糖。另外賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）、賴氨酰氧化酶樣蛋白（lysyl oxidase-like protein，LOXL）和轉谷氨酰胺酶由肝星狀細胞產生并介導細胞外間隙膠原的交聯[18-20]。在正常的生理環境下基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）降解ECM 來保持肝竇間隙中的物質平衡，可是HSC 產生出來的金屬蛋白酶會改變其活性的生成，作為一種抑制劑存在[21]。當損傷刺激因素持續存在，肝星狀細胞繼續被激活并向肌成纖維細胞轉變，繼而肝竇間隙中物質交換平衡被打破，ECM 大量沉積，導致肝竇間隙的血流不暢、不可溶性纖維持續增加，肝臟的結構發生改變，肝臟的彈性降低，血管收縮門脈產生高壓，導致肝纖維化繼續加重，最終惡變。因此抑制未激活肝星狀細胞活化、已活化或變異的肝星狀細胞凋亡可以成為一個新的治療方向和研究創新點。

2.2 肝巨噬細胞

肝巨噬細胞主要由Kupffer 細胞（KCs）和單核細胞來源的巨噬細胞組成，是高度異質性的血管實質細胞（占肝細胞的10%～15%），占巨噬細胞總數的90%。這些巨噬細胞在系統內穩態、感染、肝損傷炎癥反應的啟動、纖維化的進展、促進創面愈合和肝纖維化的消退中起著關鍵作用[22]。通過肝星形細胞來相互傳輸信息是肝巨噬細胞的能力，它可以將炎癥和纖維化具現化[22]。

在早期肝損傷階段和肝損傷恢復階段，肝巨噬細胞多起到保護性作用，這種保護作用是通過分泌一些保護性炎癥因子，例如IL-6、IL-10等，IL-6 通過Stat3 信號通路上調細胞轉導抑制因子3（SOCS3）的表達，使SOCS3 與gp130 基因結合促進其轉錄，促進肝細胞存活和肝再生以及改善脂肪變性[23]。肝巨噬細胞主要分泌轉化生長因子β（TGF -β），Interleukin-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF -α）、活性氧（ROS）和脂質過氧化作用刺激肝星狀細胞的激活和增殖[15-16]。KCs 還釋放炎癥因子（如IL-6）促進炎癥反應；緩解包含CXC 亞科的趨化因子，如CXCL1、CXCL2、CXCL8和CXCL16。CXCL1、CXCL2 和CXCL8 通過與趨化因子受體CXCR1 和CXCR2 結合，釋放細胞毒素和ROS，誘導肝細胞損傷，產生和發展肝纖維化[24]。

2.3 樹突狀細胞

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是存在于人體內的一種特異的抗原提呈細胞，在人體內監視并將發現的抗原交給T 細胞后也會促進T 細胞的免疫應答，DCs 對人體的免疫系統有著重要作用[25]。DCs 由于表面標記物的不同在不同的組織中可以完全不同，存在于肝臟中的DCs 主要分布在肝組織的匯管區，來監控血源性的抗原[26]。其在肝移植免疫耐受中也是起到關鍵作用。在CCl4制造的肝纖維化小鼠模型中，停止CCl4的損傷后，使小鼠肝臟DCs 耗竭后觀察小鼠肝纖維化的消退減慢，當增加DCs 的生長因子Flt3L后，肝纖維化消退加速，說明在早期肝損傷去除階段DCs 有助于肝纖維化的消退[27]。另外研究者還發現DCs在肝纖維化的發生中還會分泌IL-6 和TNF-α 來促進炎癥反應，并促進肝星狀細胞的激活導致ECM 沉積加速，最終促進纖維化的發生[28]。可以看出DCs 在不同的時期存在不同的作用，因此關于DCs 的研究需要進一步探究。

2.4 內質網應激反應

在細胞中管理分泌和膜蛋白的合成、翻譯修飾、合成、藥物代謝等等都是內質網的工作內容[29]。內質網穩態被擾亂后，立即啟動未展開蛋白反應（unfolded protein reaction，UPR）的保護機制，稱為內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERs）[30]。UPR 由肌醇依賴酶1α、PKR 樣ER 激酶和激活轉錄因子6α 三條信號通路組成[30]。在穩態條件下，每個UPR 傳感器的腔的一側與ER是合作伙伴，主要是免疫球蛋白結合蛋白/葡萄糖調節蛋白78。合成蛋白質過程中內質網發生錯誤折疊或者未折疊的蛋白增多時，傳感器通過以上三條通路激活UPR 產生ERs 來恢復內質網的穩態，不能改變細胞衰亡的現象，也不能減少ERs和激活不了的UPR[31]。ERs 誘導細胞的凋亡機制有CHOP 途徑、IRE1/ASK1/JNK 途徑和Caspase-12 途徑，其中最主要的是CHOP 途徑[32]。CHOP在轉錄水平上激活了許多促凋亡基因，包括死亡受體5（DR5）、Bcl-2 樣蛋白11（BIM）、Gadd34和Tribble 同源物3（TRB3），且抑制抗凋亡B 細胞淋巴瘤2（BCL2）的表達，這樣就能在內質網應激反應中增加細胞衰亡的程度[33]。

肝臟參與合成白蛋白、α-1 抗胰蛋白酶和脂蛋白等多種蛋白質，由各種原因引起的急慢性肝損傷引起的肝纖維化中涉及肝細胞和肝星狀細胞的功能變化，可以推斷大量的ERs 參與其中[32]。ERs 在肝細胞和肝星狀細胞中有著不同的作用，這增加了通過UPR 理解ERs 及其下游信號在肝病中的復雜性。在一項實驗中，使用四氯化碳灌胃一次的野生型小鼠肝細胞中早期出現ERs，然后出現了肝損傷與肝細胞凋亡，小白鼠經過多次灌輸也開始肝纖維化[34]。在最近一項實驗中證實，塞來昔布可以抑制由硫代乙酰胺誘導的肝硬化大鼠內質網應激來減輕肝細胞凋亡[35]。能發現ERs是改變肝細胞衰亡的一種根據，同時也是肝纖維的產生的開始。

有一項實驗通過對輕度和重度肝纖維化患者的組織檢測發現，重度肝纖維化組織中ERs 明顯增加[36]。在小鼠模型中，肝纖維化小鼠肝組織中分離出的肝星狀細胞內ERs 水平明顯高于正常組[36]。肝星狀細胞的激活伴隨著ERs 的出現與軸索過度生長抑制因子-B 表達上調，當進行軸索過度生長抑制因子-B 敲降后檢測到ERs 減少與肝星狀細胞激活減少[37]。上述實驗可以證明一個觀點，那就是ERs 會改變肝星形細胞，將活化細胞改變成肝纖維化，逆轉成功。

肝纖維化會通過ERs 的轉變，促進細胞色素c 釋放到胞漿中，這時再激活Caspase 級聯反應，就會引起肝星狀細胞的凋亡[38-39]。有實驗證明ERs 介導的 Kupffer 細胞源性TNF-α 經TNFR/caspase-8 途徑也會誘導肝星狀細胞凋亡[40]。在另外一項藥物實驗中，異甘草酸鎂可促進肝星狀細胞的凋亡，當加入ERs 特異性抑制劑后，這種促凋亡現象被抑制，證實ERs 在肝星狀細胞的凋亡中是一個重要角色[41]。ERs 在肝纖維化的早期會促進發展，而后期大量的ERs 會促進肝星狀細胞的凋亡。上述實驗說明了一些關鍵問題，那就是ERs 誘導肝星狀細胞的減少會讓肝纖維化出現意想不到的轉變。

2.5 自噬

自噬很好的理解就是細胞在進行一種降解的過程，這種時候，蛋白質會能凝聚成集合體，將受損的細胞或者細胞群進行運輸到溶酶體里，來維持細胞的穩態[42]。自噬小體也可以稱作雙模小泡，它的形成可以看出自噬的一種開啟模式，因為這些小體會和身體中溶酶體融合繼而形成自溶酶體，這樣更加容易降解[43]。參與自噬小體形成的Atg 蛋白由幾個功能單位組成:Atg1 激酶及其調節劑、PI3K 復合物、Atg9、ATG2-ATG18 復合物和兩種泛素樣偶聯物[44]。

自噬在大多數類型的肝細胞中被認為是一種細胞保護和抗纖維化機制，對肝細胞的代謝穩態非常重要[45]。自噬在肝纖維化的產生機制中比較復雜，在肝纖維化不同時期發生于不同細胞，產生不同的反應。肝纖維化的核心模式是需要靠激活肝星形細胞來決定的，實驗也漸漸發現這一規律，說明自噬能調節脂滴，并且適當活化肝星狀細胞的運作[46]。激活了肝星狀細胞的時候，產生出和自噬有關的特征就會越加明顯，如自噬空泡、自噬通量和LC3-II 水平都會影響到肝星形細胞的數量[46]。在體外細胞實驗中用3-甲基腺嘌呤（3-MA）或針對Atg5 的特異性siRNAs 阻斷培養細胞的自噬，可以導致肝星狀細胞活化和纖維化的減弱[46]。有實驗證明自噬缺陷型巨噬細胞通過分泌炎性細胞因子IL-1A 和IL-1B 增強肝肌成纖維細胞的纖維化特性，這個可以解釋肝巨噬細胞有著自我吞噬能力，而這種能力會保護[47]。肝細胞的慢性持續性損傷是肝纖維化的早期進程，有實驗證明自噬在肝細胞中具有保護作用，也具有抗纖維化作用[48-49]。

3 小結

所有慢性或者急性肝病都有著復雜的病理過程，其中都有肝纖維化反應的參與，進些年的研究中已證實早期的肝組織纖維化是可逆的。因此，在肝組織纖維化的早期及時干預，阻止其進一步惡化是非常有臨床意義的。實驗表明，不同細胞和細胞因子都會在不同發展狀況時參與肝纖維化反應。肝纖維化是一個動態發展過程，除了與肝星狀細胞、肝巨噬細胞、自噬、內質網應激和細胞相關因子等有關，還有一些更為復雜的因素，例如氧化應激反應、慢性炎癥反應等。針對肝纖維化的治療藥物已被證實在小鼠或者體外細胞實驗中有效，但是治療效果依然需要繼續研究。在臨床上關于肝纖維化的治療，最關鍵的措施依然是早期去除病因治療（控制體重、戒酒、早期積極病毒性肝炎規律治療等）。肝星狀細胞與細胞通路中重要的細胞因子仍然是治療肝纖維化的研究熱點，臨床工作中想要高效地治療肝纖維化還需要進一步的探究。