基于16S rRNA高通量測序分析9種中藥飲片污染微生物群落特征*

陳 柯，陳 敏，林 黎，鄒惠亮

（湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

中藥飲片是一種特殊的藥品類型，是指中藥材經過適當的炮制后制成的可直接用于中醫臨床或制劑生產使用的一類藥品。中藥飲片來源多樣，特別是植物和動物來源的飲片在加工炮制、運輸和儲存過程中容易受到微生物污染，從而影響中藥飲片的藥效和質量安全[1]。近年來，在國家藥品監督管理局展開的質量抽檢活動中多次發現中藥飲片質量不合格，其中微生物污染是導致其合格率低的重要原因之一[2-3]。目前，《中華人民共和國藥典》（2020年版）中對中藥飲片微生物限度的檢查方法沿用的仍然是傳統的平板培養法，但這種方法的檢出率較低，有研究[4]表明，平板培養只能獲得不到1%的可培養微生物，這無法全面反映受污染的中藥飲片的微生物的實際情況，而病原微生物的污染卻有可能對人體帶來極其嚴重的危害。因此，對中藥飲片中的微生物群落特征進行鑒定具有重要意義。隨著分子生物技術的飛速發展，高通量測序可以同時對海量的基因序列進行測定，具有高輸出量和高解析度的優點[5]，可以在大大縮短時間的同時提供豐富的遺傳學信息。本研究擬采用高通量測序對浙江省湖州市南太湖地區9種中藥飲片（每個品種10個批次，共計90批）進行16S核糖體RNA（16S rRNA）測序，獲得其污染微生物的菌落特征，了解中藥飲片微生物污染的實際情況，以期為中藥飲片微生物限度的控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Miseq核酸測序儀（美國Illumina公司）、QuantStudioTM 6 Flex實時定量PCR擴增儀（賽默飛世爾科技公司）、SH-2020A全自動瓊脂凝膠糖電泳儀（北京金桑特醫用儀器有限公司）、MiSeq DNA Flex制備試劑盒（美國Illumina公司）、SYBR Premix Ex Taq ⅡDNA聚合酶試劑盒（日本TAKARA公司）。

1.2 方法

1.2.1 中藥飲片采集 柴胡、白術、山藥、玄參、麥冬、焦梔子、砂仁、鐵皮楓斗、金銀花共計9種來源于南太湖地區的中藥飲片品種，每個品種10個批次，共收集中藥飲片樣品90批。每批取100 g樣品在無菌條件下進行粉碎，取粉末待測。

1.2.2 控制菌檢查 根據《中華人民共和國藥典》2020年版四部[6]中關于中藥飲片微生物限度檢查法的相關要求進行耐膽鹽革蘭氏陰性菌和沙門菌的檢查。

（1）耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢查：取10 g待測樣品，與TSB培養基以1∶10的比例進行混合，在20～25 ℃條件下培養2 h，取相當于供試品0.1 g的預培養物接種至腸道菌增菌液體培養基中，于35 ℃條件下培養48 h，然后于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上進行劃線接種，接種后繼續于35 ℃條件下培養24 h。

（2）沙門氏菌檢查：取10 g待測樣品，與TSB培養基以1:10的比例進行混合，在33 ℃條件下培養24 h，取0.1 mL培養物接種至10 mL RV沙門增菌液體培養基，繼續33 ℃培養24 h，然后于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上進行劃線接種，接種后繼續于33 ℃條件下培養48 h。

（3）菌落鑒定：挑取上述平板培養基中不同形態的微生物菌落，再次劃線接種于TSA平板培養基中，分離純化后采用VITEK生化鑒定系統進行鑒定。

1.2.3 高通量測序 先采用DNA試劑盒抽提DNA，然后進行PCR擴增，引物設計如下：

上游引物：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

下游引物：926R5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’。

擴增條件為：95 ℃預變性3 min，95℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃保持7 min，共35個循環。分別對細菌16S rRNA的V4-V5區進行PCR擴增，擴增結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別測定260 nm和280 nm下的吸光度值（OD值），并采用兩者的比值評價DNA的純度。然后采用凝膠回收試劑盒回收PCR陽性擴增產物，并以其為模板，進行二次PCR擴增，獲得的PCR產物，采用Quanti FluorTM-ST藍色熒光定量系統進行定量分析，然后按照測序要求進行混勻，采用MiSeq Reagent Kit v3（2×300 cycle）芯片進行測序。

1.2.4 多樣性分析 測得的序列采用FLASH和Trimmomatic軟件進行序列優化，獲得有效序列，將最終優化后的序列與數據庫中16S rRNA序列進行比對，并對上述序列進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分類，以97%的相似度聚類成同一個OUT，給予OUT序列進行α多樣性（alpha diversity）分析，獲得豐富度指數（Chaol指數）和多樣性指數，多樣性指數包括香農指數（Shannon index）和辛普森指數（Simpson index），在各分類水平上進行微生物群落特征分析。

2 結果

2.1 控制菌檢查結果 90批中藥飲片中有1批山藥檢測出沙門菌和大腸埃希菌，有41批檢出耐膽鹽革蘭氏陰性菌，各中藥飲片的的耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率見表1。其中檢出率最低的3種為焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗，檢出率最高的3種為山藥、金銀花和白術，這3種飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率明顯高于其它中藥飲片，差異均有統計學意義（P＜0.05），總檢出率為45.56%。

表1 9 種中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率

2.2 菌落鑒定結果 9種中藥飲片中共鑒定出腸桿菌科、假單胞菌科、巴斯德氏菌科、莫拉菌科4個科的污染微生物，其中腸桿菌科檢出比例最高。鑒定出的微生物包括腸桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、克羅諾桿菌屬、沙門氏菌屬、埃希菌屬、巴斯德氏菌屬、克雷伯氏菌屬、不動桿菌屬、變形桿菌屬共10個屬。鑒定出的微生物包括產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、成團泛菌、赫氏埃希菌、銅綠假單胞菌、中間腸桿菌、阪崎克羅諾桿菌、沙門氏菌、大腸埃希菌、多殺巴斯德氏菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、產粘變形桿菌、奇異變形桿菌共15個種。（見表2）

表2 9 種中藥飲片微生物鑒定結果

2.3 16S rRNA高通量測序結果 通過高通量測序獲得上述9種中藥飲片的有效序列，并對所有有效序列進行Tags聚類分析，并在97%的相似度下進一步進行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類分析。其中柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列，分別為33 691、33 284、33 169，鐵皮楓斗獲得最少的有效序列。所有樣品經OTUs分析共計產生1 322個OTUs，其中前三位為柴胡、金銀花、山藥，其OTUs數量分別為184、173、162。（見表3）對上述樣品在97%的相似度閾值下進行α多樣性分析，共獲得186種污染微生物，并獲得各樣品的豐富度指數（Chaol指數）和多樣性指數（Shannon指數、Simpson指數）。（見表4）Chaol指數越大說明豐富度越高，Shannon指數、Simpson指數越大說明多樣性越高。

表3 9 種中藥飲片高通量測序序列統計

2.4 屬水平微生物分布情況 在屬水平對9種中藥飲片中的污染微生物進行統計，相對豐富≥0.01的污染微生物共有32個屬，優勢均屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。其中柴胡、玄參、鐵皮楓斗的優勢菌屬為腸桿菌屬，白術、山藥、焦梔子、砂仁、金銀花的優勢菌屬為泛菌屬，麥冬的優勢菌屬為鏈球菌。（見圖1）

圖1 9 種中藥飲片屬水平微生物相對豐富分布情況

3 討論

本研究選取的研究對象為9種常見的中藥飲片[7]，控制菌檢查結果發現耐膽鹽革蘭氏陰性菌檢出率為45.56%，沙門菌和大腸埃希菌也被檢出。沙門氏菌是誘發傷寒和急性腸胃炎的主要元兇，嚴重時可誘發敗血癥，危急生命安全[8]。大腸埃希菌正常情況下對人體無害，但某些類型的大腸埃希菌能通過產生內毒素來誘發腹瀉[9]。本次結果還發現焦梔子、麥冬和鐵皮楓斗這3種經過炒制或者加熱烘干的飲片的檢出率最低。范一靈等[10]對100批中藥飲片進行需氧菌、霉菌、酵母菌及耐熱菌檢測，發現耐熱菌檢出率為61%，微生物風險殘留較高。甘永琦等[11]對廣西等地區9種中藥飲片的微生物污染現狀進行調查，發現莖類飲片耐膽鹽革蘭氏陰性菌和耐熱菌污染率較高，而果實類飲片霉菌污染率較高。經鑒定9種中藥飲片中共鑒定出4個科、10個屬共15種污染微生物。其中除沙門氏菌外，還檢測出了陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等重要的條件致病菌。微生物污染不僅有可能影響中藥飲片的質量和療效，還可能影響其安全性[12]。該結果提示中藥飲片中的病原菌微生物污染不容忽視。

為了對中藥飲片中的微生物污染情況進行全面分析，本研究進一步采用高通量測序，結果在柴胡、砂仁和山藥獲得最多有效序列，通常認為一個有效序列來自于一種菌，提示這3種中藥飲片中的基因信息最多。再進一步進行OTUs聚類分析以獲得各種中藥飲片中微生物的種屬信息，結果發現柴胡、白術和山藥具有最高的Chaol指數，柴胡、山藥和砂仁具有最高的Shannon指數，柴胡、山藥和砂仁具有最高的Simpson指數。而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗這3種飲片觀察到的微生物種類，以及Chaol指數、Shannon指數和Simpson指數都相對最低，這可能是由于其炮制過程有經過炒制和加熱有關，該結果與前文控制菌檢查結果有相似之處。其中，Chaol指數越代表物種數量，Chaol指數越高，群落的豐富度越高；Shannon指數是描述的是種的個體出現的紊亂和不確定性，Shannon指數越高，群落的多樣性也就越高；Simpson指數指數代表的是群落中種數個體分配的均勻程度，Simpson指數越高，群落多樣性越好。這3種指數是通過不同的算法來反應微生物群落的豐富度和均勻度，指數越高，通常代表微生物群落的多樣性越豐富[13-14]，以上結果提示柴胡、白術、山藥和砂仁這4種中藥飲片中的微生物多樣性最為豐富，而麥冬、焦梔子和鐵皮楓斗中的微生物多樣性最少。

高通量測序共獲得186種污染微生物，其數量遠遠高于控制菌檢出的15種污染微生物，且各種飲片在屬水平上具有很大差異，檢出最多的屬為腸桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、克羅諾桿菌屬、克雷伯氏菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬。甘永琦等[15]通過飛行時間質譜（TOF-MS）和高通量測序對多種中藥飲片中的耐膽鹽微生物群落進行分析，發現最主要的微生物為腸桿菌科和假單胞菌科，屬水平上檢出率最高為腸桿菌屬和泛菌屬，與本研究有相似之處。腸桿菌屬包含陰溝腸桿菌等能誘發下呼吸道感染、軟組織感染的病原菌，這類病原菌對消毒劑和抗生素具有強烈的抵抗力，具有較強的耐藥性[16]。假單胞菌屬的銅綠假單胞菌是繼發性感染的主要條件致病菌，變形桿菌可導致腹膜炎、腦膜炎和敗血癥等，鮑曼不動桿菌可導致呼吸道感染、泌尿系統感染、繼發性腦膜炎等多種感染性疾病，肺炎克雷伯氏菌可以導致肺炎和敗血癥[17]。以上微生物都是引起醫院感染的重要病原菌。除了控制菌檢出的污染微生物外，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等菌屬僅在高通量測序中檢出，且經相對豐度指數分析發現麥冬的優勢菌屬為鏈球菌。而這些菌屬是主要的致病菌和條件致病菌所在屬，金黃色葡萄球菌能引發食物中毒和多種化膿性炎癥；鏈球菌屬包含肺炎鏈球菌等多種致病菌，能引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、敗血癥、腦膜等多種臨床疾病；腸球菌屬對多種抗菌藥具有固有耐藥性，是僅次于葡萄球菌屬的最重要的醫院感染病原菌。

綜上所述，中藥飲片中存在微生物污染情況，并包含致病菌，具有一定的致病風險。高通量測序可以無需通過微生物培養即可獲得中藥飲片中的微生物群落特征信息，與傳統平板培養相比較，更加快速和全面。