參竹心康湯通過miRNA-21調(diào)控EndMT影響心肌纖維化的實驗研究*

瞿雙勇，陳志紅，成笑楠，朱筱婧，趙 啟，喻正科

（1.天長市中醫(yī)院，安徽 天長 239300；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006；3.湖南中醫(yī)藥高等專科學校，湖南 株洲 412012）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）的特點是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生和降解不平衡，導致ECM過度積累的過程。而過量的ECM沉積引起心肌結(jié)構、表型和功能發(fā)生改變，使心肌僵硬，心臟順應性降低，影響心臟收縮與舒張功能，最終導致心力衰竭。心肌纖維化是決定心血管疾病預后的主要因素。因此，如何有效改善心肌纖維化具有重要意義。但心肌纖維化原因復雜，發(fā)生發(fā)展機制尚不十分清楚。KUMARSWAMY R等[1]通過TGF-β1誘導內(nèi)皮向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）并調(diào)節(jié)微小RNA-21（miRNA-21）基因表達發(fā)現(xiàn)，miRNA-21能促進心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，其部分作用是通過TGF-β1介導的EndMT實現(xiàn)的。LI F P等[2]通過實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA-21的表達可以下調(diào)PTEN水平。而磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）具有磷脂酰肌醇3-磷酸酶活性，能夠獨立地抑制PI3K/Akt通路[3]，Akt具有促進細胞增殖的作用。由此可知，miRNA-21可以通過下調(diào)PTEN水平，從而促進PI3K/Akt通路的表達，導致內(nèi)皮細胞過度克隆，向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引起內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終促進MF的發(fā)生，而中醫(yī)藥改善心肌纖維化有一定優(yōu)勢[4]。

參竹心康湯是本團隊臨床上用于治療慢性心力衰竭心肌纖維化的有效方藥，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的功效。臨床研究[5]提示，參竹心康湯可以改善心力衰竭患者癥狀，提高射血分數(shù)（ejection fraction，EF），提升心力衰竭患者的生活質(zhì)量。前期動物實驗[6-7]表明，參竹心康湯作用于心力衰竭模型大鼠后，能夠改善其心肌重構，具有抗心肌纖維化作用。本研究通過觀察參竹心康湯對EndMT的影響及其對miRNA-21調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路的影響，探討其作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)條件：溫度23～25 ℃，相對濕度50%～60%，自然光照，自由飲水、飲食。實驗經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院醫(yī)學實驗動物倫理委員會批準，批準號：NO.2020-0063。所有操作均嚴格遵循實驗動物管理相關規(guī)定。

1.2 細胞 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）（批號：8000）購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3 藥物與試劑 參竹心康湯，方藥組成：黨參20 g，麥冬15 g，炙黃芪20 g，五味子5 g，玉竹15 g，丹參20 g，田三七5 g，黃精15 g，葶藶子6 g，姜黃10 g，澤蘭10 g。上述藥材均購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房，由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院田其學主任藥師、周知午主任藥師鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。將以上飲片以6倍清水浸泡20 min后，煎煮40 min，取藥液，分離藥渣；再以5倍清水煎煮藥渣40 min，合并兩次藥液，混勻，濃縮至生藥濃度為4.5 g/mL，4 ℃保存。卡托普利（囯藥準字H42020384，批號：20190022）購自華中藥業(yè)公司，研磨成細粉后加入蒸餾水中以超聲震蕩制成質(zhì)量濃度為3.25 mg/mL的混懸液，4 ℃冰箱冷藏備用；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2141）、UltraSYBR Mixture（批號：CW2601）均購自北京康為世紀有限公司；CD31一抗（批號：ab24590）、FSP1一抗（批號：ab197896）、α-SMA一抗（批號：ab7817）、TIMP1一抗（批號：ab109125）、MMP-9一抗（批號：ab38898）均購自abcam公司；PTEN一抗（批號：22034-1-AP）、PI3K一抗（批號：21890-1-AP）、Akt一抗（批號：10176-2-AP）、p-Akt一抗（批號：66444-1-Ig）、β-actin一抗（批號：66009-1-Ig）、FSP1、CD31、CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（批號：SA00013-2）、HRP goat anti-mouse IgG（批號：SA00001-1）、HRP goat antirabbit IgG（批號：SA00001-2）均購自proteintech公司。

1.4 主要儀器 DH-160I型直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器公司）；DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器公司）；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京永光明醫(yī)療公司）；MB-530型多功能酶標分析儀（深圳匯松公司）；PIKOREAL96型熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光P CR板（美國Thermo公司）；BioPrep-24型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛公司）；DYY-2C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備 SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為中藥組和空白組，每組10只。前期研究表明，參竹心康湯灌胃劑量在44 g/kg時對心肌纖維化大鼠療效最佳[8]，故本次研究中大鼠每日灌胃劑量為44 g/kg。中藥組大鼠灌胃給予參竹心康湯，44 g/(kg·d)；空白組大鼠灌胃給予生理鹽水，10 mL/kg，1次/d，連續(xù)7 d。最后一次灌胃1 h后，以10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉。腹主動脈采血，采用頸椎脫臼法處死實驗大鼠。血液標本以4 ℃2 500 r/min離心15 min取血清，放入56 ℃水浴鍋滅活補體，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，獲得含藥血清及空白血清，置-20 ℃冰箱保存。

2.2 HUVEC細胞分組 取HUVEC細胞分為對照組、模型組、陽性對照組和參竹心康湯組。其中對照組不做特殊處理，模型組使用10 ng/mL TGF-β1+20%空白血清處理，陽性對照組使用10 ng/mL TGF-β1+10 μmol/L卡托普利+20%空白血清處理，參竹心康湯組使用10 ng/mL TGF-β1+20%含藥血清處理。

2.3 細胞免疫熒光法（IF）測定EndMT相關標志物CD31、α-SMA、FSP1蛋白的表達水平 取指數(shù)生長期細胞，分組培養(yǎng)；用4%多聚甲醛固定30 min后，用PBS洗滌3次，5 min/次；5%BSA 37 ℃封閉60 min；滴加1∶50稀釋的一抗（CD31、FSP1、α-SMA），4 ℃過夜。PBS沖洗3次，5 min/次；滴加50～100 μL抗-Mouse、Rabbit、Mouse-IgG標記熒光抗體（稀釋比例1∶200），37 ℃孵育90 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAPI工作液37 ℃染核10 min，PBS沖洗3次，5 min/次；緩沖甘油封片；避光保存。然后在熒光顯微鏡下觀察。使用image pro plus軟件分析，得到各組IOD值。

2.4 ELISA法檢測collagenⅠ含量 收集細胞培養(yǎng)液上清液，嚴格按說明書操作測定上清液中collagen Ⅰ的含量。

2.5 RT-qPCR 法檢測miRNA-21 mRNA、PTEN mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量 提取總RNA后，以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。渦旋振蕩混勻，4 ℃12 000 r/min離心15 min，使管壁上的溶液收集到管底；50 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min。反應結(jié)束后，4 ℃12 000 r/min離心10 min，置于冰上冷卻；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應和熒光定量PCR反應，用1 mmol/L Tris（pH=8.0）來稀釋10 mmol/L ATP：即將ATP稀釋50倍（1 μL的10 mmol/L ATP加49 μL的1 mmol/L Tris，pH=8.0）。向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入試劑至總體積20 μL；4 ℃7 500 r/min離心5 min，將液體收集于管底，37 ℃孵育15 min。修飾后miRNA cDNA第一鏈合成的過程：向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入試劑，至終體積20 μL；混勻反應液，4 ℃7 500 r/min離心5 min，將液體收集于管底。42 ℃孵育50 min；85 ℃孵育5 min，終止反應。程序設置：95℃，10 min；95 ℃，15 s；60℃，30 s，循環(huán)40周期。

使用SYBR法，NCBI搜索目的基因序列，primer5軟件設計引物，由上海生工合成引物。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算結(jié)果。

表1 實時定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR 引物序列

2.6 蛋白免疫印跡法檢測PTEN、PI3K、Akt、pAkt及TIMP1、MMP-9蛋白相對表達量 冰預冷PBS洗滌細胞1次，加入200 μL RIPA裂解液，細胞懸液超聲破碎1.5 min；冰上裂解10 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管。配制11%分離膠，4.8%的濃縮膠。72 V電泳130 min。300 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，用1×PBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置90 min。加入一抗孵育，室溫放置90 min，其中抗體稀釋濃度為PTEN抗體（1∶2 000），PI3K抗體（1∶1 000），Akt抗體（1∶1 000），pAkt抗體（1 ∶2 000），TIMP1 抗體（1 ∶1 000），MMP-9 抗體（1∶1 000）以及β-actin抗體（1:20 000）。孵育結(jié)束，1×PBST洗3次，15 min/次。二抗孵育90 min；1×PBST洗3次，10 min/次。使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，顯影沖洗。quantity one軟件進行分析，得到PTEN/β-actin、PI3K/β-actin、TIMP1/β-actin、MMP-9/β-actin、Akt/β-actin、pAkt/β-actin數(shù)據(jù)，凈光密度用于目的蛋白表達水平的比較。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)都進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。若不滿足正態(tài)性，選用Games Howell檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組HUVEC細胞EndMT標志指標CD31、α-SMA、FSP1免疫熒光比較 細胞特異性蛋白CD31、α-SMA、FSP1染為綠色熒光，無特異性的細胞核染色為藍色熒光，MERGE為兩者融合。與對照組比較，模型組HUVEC細胞中CD31熒光強度明顯降低（P＜0.05），α-SMA、FSP1熒光強度均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中CD31熒光強度均明顯升高（P＜0.05），α-SMA、FSP1熒光強度均不同程度降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中CD31熒光強度明顯升高（P＜0.05），α-SMA、FSP1熒光強度均明顯降低（P＜0.05）。（見圖1～3、表2）

圖1 各組HUVEC 細胞中CD31 免疫熒光光鏡圖（×400）

圖2 各組HUVEC 細胞中α-SMA 免疫熒光光鏡圖（×400）

圖3 各組HUVEC 細胞中FSP1 免疫熒光光鏡圖（×400）

表2 各組HUVEC 細胞中CD31、α-SMA、FSP1 積分光密度值比較 （±s，n=3）

表2 各組HUVEC 細胞中CD31、α-SMA、FSP1 積分光密度值比較 （±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05

組別CD31(×103)α-SMA(×103)FSP1(×103)對照組154.61±6.9628.91±2.785.01±0.43模型組8.40±1.04a100.27±2.31a89.76±4.83a陽性對照組34.31±2.32ab64.76±2.90ab 58.85±1.50ab參竹心康湯組 85.28±1.51abc47.44±0.72abc 33.60±1.84abc F 290.239168.067178.613 P 0.0000.0000.000

3.2 各組HUVEC細胞中TIMP-1、MMP-9蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組HUVEC細胞中TIMP-1蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），MMP-9蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中TIMP-1蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），MMP-9蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中TIMP-1蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），MMP-9蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）。（見圖4、表3）

圖4 各組HUVEC細胞中TIMP-1、MMP-9蛋白表達免疫印跡圖

表3 各組HUVEC 細胞中TIMP-1、MMP-9 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

表3 各組HUVEC 細胞中TIMP-1、MMP-9 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05

組別TIMP-1/β-actinMMP-9/β-actin對照組0.38±0.020.06±0.01模型組0.08±0.01a0.42±0.06a陽性對照組0.20±0.03ab0.27±0.01ab參竹心康湯組0.28±0.01abc0.18±0.01abc F 45.48226.885 P 0.0000.000

3.3 各組HUVEC細胞中collagen Ⅰ含量比較 與對照組比較，模型組HUVEC細胞中collagen Ⅰ含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中collagen Ⅰ含量均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中collagen I含量明顯降低（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組HUVEC 細胞中collagen Ⅰ含量比較（±s，ng/mL，n=3）

表4 各組HUVEC 細胞中collagen Ⅰ含量比較（±s，ng/mL，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05

組別collagen Ⅰ對照組3.12±0.10模型組14.21±0.06a陽性對照組8.27±0.06ab參竹心康湯組5.07±0.11abc F 3 352.953 P 0.000

3.4 各組HUVEC細胞中miRNA-21相對表達量比較 與對照組比較，模型組HUVEC細胞中miRNA-21相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中miRNA-21相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中miRNA-21相對表達量降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組HUVEC 細胞中miRNA-21 相對表達量比較（±s，n=3）

表5 各組HUVEC 細胞中miRNA-21 相對表達量比較（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別miRNA-21對照組0.98±0.02模型組8.03±0.89a陽性對照組3.20±0.23ab參竹心康湯組2.84±0.10ab F 42.322 P 0.000

3.5 各組HUVEC細胞中PTEN mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量比較 與對照組比較，模型組HUVEC細胞中PTEN mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05），而PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中PTEN mRNA相對表達量均明顯升高（P＜0.05），而PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中PTEN mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），而PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量均明顯降低（P＜0.05）。（見表6）

表6 各組HUVEC 細胞中PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相對表達量比較 （±s，n=3）

表6 各組HUVEC 細胞中PTEN mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA 相對表達量比較 （±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05

組別PTENPI3KAkt對照組1.06±0.051.00±0.021.08±0.03模型組0.20±0.02a5.51±0.28a5.61±0.48a陽性對照組0.46±0.04ab3.88±0.09ab3.23±0.09ab參竹心康湯組 0.76±0.04abc1.78±0.23abc 1.89±0.07abc F 98.982117.43464.972 P 0.0000.0000.000

3.6 各組HUVEC細胞中PTEN、PI3K、pAkt、Akt蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組HUVEC細胞中PTEN蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），而PI3K蛋白相對表達量及pAkt/Akt值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、參竹心康湯組HUVEC細胞中PTEN蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），而PI3K蛋白相對表達量及pAkt/Akt值均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，參竹心康湯組HUVEC細胞中PTEN蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），而PI3K蛋白相對表達量及pAkt/Akt值明顯降低（P＜0.05）。（見圖5、表7）

圖5 各組HUVEC 細胞中PTEN、PI3K、pAkt、Akt蛋白表達免疫印跡圖

表7 各組HUVEC 細胞中PTEN、PI3K、pAkt、Akt 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

表7 各組HUVEC 細胞中PTEN、PI3K、pAkt、Akt 蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05

組別PTEN/β-actin PI3K/β-actin pAkt/Akt對照組0.38±0.030.08±0.020.12±0.01模型組0.06±0.01a0.56±0.01a0.67±0.02a陽性對照組0.14±0.01ab0.43±0.01ab0.57±0.04ab參竹心康湯組 0.28±0.02abc0.27±0.02abc 0.30±0.05abc F 73.976173.64163.697 P 0.0000.0000.000

4 討論

心肌纖維化是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的一個重要病理過程，是心肌重構的主要表現(xiàn)[9]。心肌成纖維細胞是心肌纖維化過程的主要效應細胞，而心肌成纖維細胞的增加主要來源于心臟原位細胞增殖、骨髓干細胞增殖及EndMT的內(nèi)皮細胞，其中后者約占成纖維細胞增加來源的32%[10]。EndMT具體表現(xiàn)為細胞內(nèi)骨架蛋白重新排列，并可出現(xiàn)偽足；內(nèi)皮細胞的特異性標志物，如血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1/CD31（PECAM-1/CD31）表達逐漸減弱或喪失，轉(zhuǎn)而表達活化的成纖維細胞特異性標志物，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞特異性蛋白-1（FSP-1）等；同時伴有細胞間連接減少，細胞從血管內(nèi)皮層脫離，而遷移和增殖的能力增強。研究[11-12]表明，EndMT與心肌纖維化之間存在著密切的聯(lián)系，抑制EndMT可明顯改善心功能[13]。

小分子RNA（MicroRNA，miRNA）是真核生物中長為20～25個核苷酸、具有調(diào)控功能的非編碼RNA。miRNA可通過5’端堿基識別靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)（Untranslatedregion，UTR），促進mRNA降解、阻遏mRNA翻譯、隔離mRNA靶基因，從而調(diào)節(jié)細胞的分化、凋亡、增殖與發(fā)育[14-15]。近幾年，研究表明，miRNA在很多疾病（如心力衰竭、心肌肥厚、心肌纖維化、肺纖維化等）中都有不同程度的異常表達。THUM T等[16]發(fā)現(xiàn)心功能不全的心肌成纖維細胞中，miRNA-21表達顯著上調(diào)。在垂體后葉素所導致的大鼠心肌損傷與心肌纖維化模型中，L7DG通過調(diào)節(jié)miR-21表達，從而減少TGF-β誘導的心肌纖維化[17-18]。TGF-β可誘導發(fā)生EndMT，而下調(diào)miRNA-21可部分抑制EndMT發(fā)生，表明miRNAs可能參與了EndMT的調(diào)控[19]。GUO Y M等[20]研究表明，人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白（Kallistatin）可抑制通過miRNA-21調(diào)控由TGF-β誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞EndMT。PTEN具有磷脂酰肌醇3-磷酸酶活性，是一個很有效的PI3K/Akt通路負性調(diào)節(jié)因子，能催化3’4’5’-三磷酸脂肌醇（PIP3）的3位脫磷酸酶，從而下調(diào)PIP3的水平。PIP3能激活原癌基因產(chǎn)物絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt），后者通過激活下游級聯(lián)反應，從而參與細胞的生長、分化、凋亡和遷移的調(diào)控。PTEN能獨立通過抑制PI3K/Akt信號通路來控制凋亡和細胞周期，抑制PTEN/Akt通路可能延緩心室重構和心力衰竭的病程進展[21]。迄今有文獻記載的miRNA-21介導的心血管效應的靶基因有4個，磷酸脂酶-張力蛋白同源物（PTEN）是其中之一。ROY S等[22]研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注誘導小鼠的心臟重構模型中，PTEN是miR-21在心肌成纖維細胞上的靶基因。

心肌細胞外基質(zhì)（ECM）代謝失衡是引發(fā)心肌纖維化的重要原因。間質(zhì)型膠原Ⅰ型（CollagenⅠ）在心肌纖維化過程中占有重要的地位。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是調(diào)控心肌ECM合成與降解的重要酶系，當MMPs與TIMPs表達失衡會導致ECM合成與降解異常，引起心肌纖維化。MMP-9又稱明膠酶B，可降解ECM中的膠原，影響細胞外基質(zhì)重塑。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑。如果降解的膠原蛋白被缺乏鏈接結(jié)構的纖維性間質(zhì)所取代，纖維膠原網(wǎng)絡被破壞則導致心肌纖維化[23]。研究表明，MMPs/TIMPs比值通常決定ECM蛋白降解和組織重塑的程度，比值降低時，可以改善纖維化[24]。

本研究結(jié)果表明，模型組HUVEC細胞CD31熒光強度，PTEN mRNA相對表達量，TIMP-1、PTEN蛋白相對表達量均明顯降低；α-SMA、FSP1熒光強度，collagenⅠ含量，miRNA-21 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA相對表達量，MMP-9、PI3K、蛋白相對表達量及pAkt/Akt值均明顯升高。提示內(nèi)皮細胞來源的成纖維細胞中CD31含量降低，α-SMA、FSP1含量升高。TGF-β1可誘導HUVEC產(chǎn)生EndMT。參竹心康湯組HUVEC細胞中CD31熒光強度升高，α-SMA、FSP1熒光強度均降低，顯示參竹心康湯能抑制成纖維細胞分泌α-SMA、FSP1，并促進CD31表達，說明該方能抑制HUVEC出現(xiàn)EndMT。在此基礎上，本研究觀察了參竹心康湯對TGF-β1誘導的HUVEC間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化后的影響，其結(jié)果顯示，干預后TIMP-1蛋白相對表達量明顯升高，MMP-9蛋白相對表達量、collagen Ⅰ含量均明顯降低，提示參竹心康湯具有抗心肌纖維化的作用。進一步觀察表明，參竹心康湯可下調(diào)miRNA-21的表達，同時能抑制PI3K mRNA、Akt mRNA表達，降低pAkt/Akt比值；上調(diào)這一過程中PTEN mRNA表達及蛋白含量。這可能是其抑制HUVEC出現(xiàn)EndMT的機制之一。

綜上所述，參竹心康湯可以抑制EndMT，從而起到抗心肌纖維化作用。其可能機制與該方下調(diào)miRNA-21水平，抑制PTEN/PI3K/AKT通路有關。