坤靈丸對卵巢儲備功能下降患者體外受精-胚胎移植胚胎質量的影響

王海燕，邵小光，王美仙，黃杰，陶仕英，史艷彬，王磊，牛建昭，李健*（. 北京中醫藥大學中醫學院組織胚胎學教研室，北京 040；. 大連市婦女兒童醫療中心（集團），大連 遼寧 6000）

近年來，體外受精-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）應用于不孕不育患者使眾多婦女成功妊娠。但卵巢功能是否正常對體外受精（IVF）妊娠率的影響較大。很多學者研究發現卵巢儲備功能低下（DOR）的患者，其妊娠率低，周期取消率高。DOR指卵巢皮質區卵泡生長發育并形成可受精卵母細胞的能力，此能力取決于原始卵泡的數量和質量。若卵巢內可募集的卵泡數量減少或卵母細胞質量下降，配子生成功能下降，可致生育能力下降，稱作卵巢儲備功能減退，也叫卵巢儲備功能下降。臨床研究發現，DOR患者容易發生卵巢低反應性（POR），而且胚胎質量差，影響臨床妊娠率，如何改善DOR患者的胚胎質量是如今研究的熱點。

中醫認為，DOR的主要病機是腎精不足、腎虛血瘀。中藥坤靈丸是臨床常用中成藥，具有調經養血、逐瘀生新的作用，用于月經不調、宮寒、久不受孕、習慣性流產等的治療。現代研究表明，坤靈丸其活血化瘀成分對于改善子宮動脈血流有一定的作用。子宮動脈的卵巢支供血卵巢，因此推測坤靈丸改善卵巢血供對提高卵巢功能可能有益。

本文采用隨機對照方法，觀察了坤靈丸對DOR患者IVF/ICSI-ET后胚胎質量的影響，探索針對DOR患者開展人工輔助生殖的預處理策略，為坤靈丸在臨床的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 DOR患者的納入/排除標準

納入標準：患者年齡25～42歲（包括25及42歲）；符合博洛尼亞DOR診斷標準[自然周期雙側卵巢竇卵泡（AFC）＜7個和/或抗苗勒氏管激素（AMH）＜1.1 ng·mL]，且治療前3個月均未使用任何改善卵巢儲備功能的藥物治療。

排除標準：排除染色體核型異常、生殖器官畸形、手術切除單側卵巢、腫瘤放療化療術后患者；排除早發型卵巢儲備功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）患者。

1.2 研究對象

本研究經大連市婦女兒童醫療中心倫理委員會批準（批準文件號：2020010）。納入2020年1月至2021年4月于本中心就診行IVF/ICSI-ET助孕的DOR患者，共100例，隨機分為兩組：坤靈丸組和對照組，各50例，對DOR患者IVFET治療后的采卵后各項指標情況進行觀察。坤靈丸組脫落4例（不能按時服藥3例，發熱未采卵1例），對照組脫落1例（發熱未采卵）。坤靈丸組和對照組分別含46例和49例DOR患者，采集靜脈血及進行超聲AFC監測。坤靈丸組口服坤靈丸15丸Bid，用藥兩個月經周期后來月經第3～5日進行拮抗劑促排，并繼續口服坤靈丸至采卵日。對照組應用拮抗劑方案促排卵。分析坤靈丸組及對照組DOR患者的激素水平變化、獲卵數目、2個原核（2PN）受精數目，2PN受精率、可利用胚胎數目、優質胚胎數目、優質胚胎率及注射絨毛膜促性腺激素日（hCG日）E濃度。

1.3 試藥和儀器

三維彩超（美國Voluson E8，GE）。三氣細胞培養箱（德國Labotect C200），所有胚胎使用一步培養液（美國globaltotal LP）培養，2PN胚胎培養至第3日（D3，采卵日為D0）移植或冷凍。Leica DM 2500顯微鏡（德國徠卡公司）。BCS196低溫冷臺（Linkam Scientic Instruments，英國）。

坤靈丸[天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司，濃縮丸，規格：0.125 g/丸]。尿促性素（hMG，75 U/支，麗珠集團麗珠制藥廠），果納芬注射液（450 U/支，默克雪蘭諾），西曲瑞克（0.25 mg/支，默克雪蘭諾），醋酸加尼瑞克（0.25 mg/支，默沙東公司）。絨毛膜促性腺激素（hCG，麗珠集團麗珠制藥廠），醋酸曲普瑞林注射液（德國輝凌制藥有限公司，0.1 mg/支）。

1.4 促排方案

來月經第2～4日開始應用hMG或果納芬注射液150～300 U促排，卵泡在12～14 mm時根據黃體生成素水平應用拮抗劑注射用西曲瑞克0.25 mg或注射用醋酸加尼瑞克0.25 mg。優勢卵泡至17～20 mm時，應用注射用hCG 10 000 U或醋酸曲普瑞林注射液0.2 mg扳機，34～36 h采卵。采卵后第1日（D1）觀察是否受精，D3觀察胚胎質量。視情況選擇胚胎冷凍或新鮮移植，移植后12～14 d觀察是否受孕。

1.5 優質胚胎診斷標準

優質胚胎：D3 評估6細胞以上1～2級的優質胚胎為優質胚胎（來源于2PN），碎片小于30%的胚胎為可利用胚胎，可以進行移植或冷凍。可用胚胎：6細胞3級以上的胚胎，可以移植或冷凍。1級胚胎，卵裂球大小均等，透亮，無碎片；2級胚胎，卵裂球大小不均等和/或碎片率小于10%；3級胚胎，碎片率10%～50%；4級胚胎：碎片率＞50%。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。非正態分布的數據用中位數（四位間距）[M（P，P）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。正態分布數據用均值±標準差（±

s

）表示，組間比較采用獨立樣本

t

檢驗，

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者的年齡、基礎雌二醇（E）、基礎卵泡刺激素（FSH）、基礎黃體生成素（LH）、抗苗勒氏管激素（AMH）以及體質量指數（BMI）均無顯著差異（

P

＞0.05）（見表1）。AFC、促性腺激素（Gn）使用天數、Gn用量、受精方式、同型半胱氨酸差異均無統計學意義。

表1 兩組患者一般資料比較[M(P，P)]
Tab 1 General data between the two groups [M (P，P)]

特征 坤靈丸組（n＝46） 對照組（n＝49） Z/χ2 P年齡/歲 女 36.5（32，39） 36（32，38） －0.665 0.506男37（33，39.5） 35（32，38） －1.57 0.116 BMI/（kg·m—2） 22.2（20.15，23.9） 20.85（19.38，25.5） －0.782 0.434不孕年限/年 2（1，4） 2.5（2，5） －1.258 0.208原發或繼發不孕/例 原發 27 27 0.125 0.724繼發 19 22受精方式/例 IVF 27 32 0.441 0.507 ICSI 19 17 AFC/個 4（3，5） 4（3，5.5） －0.782 0.434 AMH/（ng·L－1） 0.6（0.49，0.78） 0.69（0.47，0.95） －1.367 0.172基礎E2/（pg·mL—1） 40.00（29.48，48.07） 47（33.59，63.93） －1.780 0.075基礎FSH/（IU·L—1） 8.85（6.89，11.92） 8.48（6.98，11.67） －0.045 0.964基礎LH/（IU·L—1） 4.34（3.18，7.16） 4.59（3.45，5.7） －0.424 0.671 PRL/（ng·mL—1） 13.54（10.86，20.83） 15.36（11.9，19.31） 0.385 0.700 CA125/（U·mL—1） 14.32（9.21，22.40） 18.11（14.14，26.31） －1.664 0.096同型半胱氨酸 7.35（6.13，9.05） 8（7，9.83） －1.654 0.098 Gn起始量/U 300（281.25，300） 300（225，300） －0.237 －0.813 Gn使用天數/d 9（8，10） 8.5（7，10） －0.928 0.354 Gn用量/U 2475（2006.25，3000） 2400（1968.75，3000） －0.636 0.524

2.2 坤靈丸組用藥前后激素水平和AFC比較

坤靈丸組用藥后 FSH、LH水平低于用藥前（Z＝－3.202、－3.116，

P

＝0.001、0.002）。坤靈丸預處理前后E、AFC無明顯區別（Z＝－0.551，－1.073，

P

＝0.582、0.283）。結果見表2。

表2 坤靈丸組用藥前后激素水平和AFC比較
Tab 2 Hormone level and AFC in Kunling pill group before and after the treatment

注（Note）：與坤靈丸組用藥后比較，＜0.05（Compared with the Kunling pill group after the treatment，＜0.05）。

時間 E2/（pg·mL－1） FSH /（IU·L－1） LH/（IU·L－1） AFC/個用藥前 40.00（29.48，48.07） 8.85（6.89，11.91）* 4.34（3.18，7.16）* 4（3，5）用藥后 36.35（32.82，45.85） 6.61（5.66，8.69） 3.23（2.34，4.38） 4（3，5）

2.3 兩組實驗室及臨床結局分析

兩組比較，獲卵數目、2PN受精受精數目、可利用胚胎數目、2PN受精率、新鮮周期著床率、妊娠率、HCG日E差異無統計學意義（

P

＞0.05）。坤靈丸組優質胚胎數目和優質胚胎率大于對照組（

P

＜0.05），移植一次妊娠率（56.25%）略高于對照組（50%），但差異無統計學意義。結果見表3。

表3 兩組患者實驗室及臨床結局比較[M(P，P)，(%)]
Tab 3 Laboratory and clinical outcomes of the two groups [M(P25，P75)，(%)]

項目 坤靈丸組（n＝46） 對照組（n＝49） Z/χ2 P獲卵數目/個 4（2.75，5） 3（2，5） －0.751 0.453 2PN受精數目/個 2.5（2，4） 3（2，3） －0.498 0.619可利用胚胎數目/個 2.5（2，3.25） 2（1，3） －0.903 0.367優質胚胎數目/個 1（0.75，2） 0（0，1） －2.936 0.003 2PN受精率 72.32%（128/177） 69.66%（124/178） 0.303 0.582優質胚胎率 45.24%（57/126） 30.43%（35/115） 5.583 0.018新鮮周期著床率 29.82%（17/57） 29.41%（15/51） 0.192 0.661移植一次妊娠率 56.25%（18/32） 50%（14/28） 0.234 0.628 HCG日E2濃度/（pg·mL－1） 873.2（622.5，1103） 918.4（607.65，1396.00） －0.284 0.776

3 討論

3.1 DOR西醫治療進展

DOR處于POI早期，無臨床癥狀，只有生化水平的異常表現，是育齡期女性最常見的生殖內分泌疾病，DOR患者所占比例在門診不孕女性中占約10%。妊娠需要優質的胚胎和良好的子宮內膜容受性，優質胚胎是妊娠發生的首要條件。由于DOR患者的異質性較高，有一部分患者因為沒有高質量的胚胎而被迫取消移植周期。因此如何獲得優質胚胎和良好的妊娠結局是研究的重點。輕度的卵巢儲備功能減退可以通過增加Gn用量改善其臨床妊娠結局；真正的POR或重度DOR，應用大劑量的Gn，即使加大Gn用量可募集到的卵子不僅數量少且質量較差，可移植胚胎數減少，妊娠率顯著下降，卵巢強力刺激并不能改善重度DOR患者的結局。如何改善DOR患者的妊娠結局，成為了眾多學者研究的熱點。有學者研究了生長激素或抗氧化制劑輔酶Q10及硫酸脫氫表雄酮在DOR或POR患者IVF中的應用，發現其可以提高DOR患者的胚胎種植率及臨床妊娠率，改善其IVF-ET結局。但缺乏大樣本的臨床對照研究，結果需進一步證實。也有學者研究雌激素、孕激素在POI和POF中的應用，有一定短期療效，但會影響肝腎代謝能力，增加患癌風險及血栓風險等，長期應用具有諸多弊端。

3.2 坤靈丸用于IVF前預處理機制

當前西醫試管嬰兒技術的應用，為DOR患者帶來了希望，但不同于卵巢儲備功能良好的患者，DOR患者基礎卵泡數目少，胚胎獲得數目少，優質胚胎相對少。有時需要反復的控制性卵巢刺激（COS）以追求更多的獲卵數和更多的胚胎，需多次采卵才能最大機會受孕。但這一治療方案價格高昂，可控的個體化 COS 方案有限。拮抗劑（GnRH-A）方案近年被臨床廣泛應用，在POR患者中，GnRH-A和GnRH-a長方案對于IVF臨床結局的影響無顯著差異，GnRH-A方案可減少Gn用量，縮短Gn用藥時間。因此本文DOR患者統一選用GnRH-A方案，對患者有益且能排除促排方案不均一的影響。在西醫促排治療的基礎上用坤靈丸預處理，調節 H-P-O 軸以改善卵巢儲備功能、提高卵巢反應性、減少激素藥物的應用、從而增加妊娠率，臨床效果好，不良反應少。坤靈丸由31味中藥材組成，其中肉蓯蓉、鹿角膠、地黃、龜甲膠、五味子起到補肝腎、益精血的作用。主要用于腎虛、氣滯血瘀，但基本涵蓋了不孕癥的基本證型，可改善卵巢功能，提高子宮內膜容受性并具有調經養血、逐瘀生新的功效，在臨床上用于促排卵、子宮內膜增生、卵巢早衰、降低IVF-ET流產率等。但尚無對DOR患者的IVF臨床對照研究。

3.3 本文研究結果及文獻回顧

本研究為前瞻性研究，結果顯示兩組基礎內分泌情況差異均無統計學意義。坤靈丸組用藥后FSH和LH水平低于用藥前，提示坤靈丸能夠調節激素水平，降低DOR患者FSH和LH水平。高FSH對胚胎質量有負面影響，降低基礎FSH水平，預防卵泡早期發育，能使促排時卵泡更加同步。研究表明，基礎FSH水平增高與獲卵數、可利用胚胎數和移植胚胎數下降顯著相關，與受精率和流產率無明顯相關性。基礎LH升高對促排過程及結局也有負面影響。外周血基礎LH升高（≥10 U·L）主要見于兩類患者，一類是臨床常見的多囊卵巢綜合征（PCOS）患者，另一類是卵巢功能低下或者衰竭的患者，以高齡或圍絕經期女性多見。從分析的數據來看，對于基礎LH水平過高（≥10 U·L）的患者，嘗試使用全程拮抗劑平穩控制LH水平是可行的，可能有助于降低高危患者早發LH峰的風險，改善助孕結局。研究結果顯示坤靈丸組獲卵數目、2PN受精數、可利用胚胎數目、移植一次妊娠率略高于對照組，而優質胚胎數目和優質胚胎率顯著優于對照組（

P

＜0.05）。有研究表明在補腎疏肝法的基礎上適當加用活血藥，可以改善血循環，增加卵巢血流量，還可以升高E、降低FSH及抑制顆粒細胞凋亡、促進血管生成，在增加卵巢指數方面均有明顯的優勢。尤昭玲等將 IVF-ET過程進行分期，并根據各期的臨床特點，應用中醫分期輔助治療，發現采用相應的中藥口服，能收集到足夠數量的優質卵細胞，提高胚胎的質量，提高子宮內膜對胚胎的容受性，達到提高臨床妊娠率和活產率的目的。張寧發現在 IVF-ET 治療前3個月，口服補腎化痰中藥能提高優質胚胎率、臨床妊娠率，降低卵巢過度刺激綜合征的發生率。動物實驗發現應用中藥方劑對DOR大鼠的卵巢功能具有保護作用。坤靈丸在大鼠胚胎-胎仔發育的藥理毒性實驗研究表明，相當于人類口服劑量43.2倍的劑量對大鼠母體及胎仔無明顯影響。因此，坤靈丸應用于臨床安全可靠。

綜上所述，坤靈丸對于提高優質胚胎數目及優質胚胎率有幫助。在IVF應用拮抗劑的基礎上預先應用坤靈丸，盡管沒有提高獲卵數目，妊娠率無顯著性差異，但是能顯著提高優質胚胎率，而且安全性高。下一步將增大樣本量，統計累計妊娠率和活產率，對坤靈丸提高DOR患者優質胚胎質量的分子機制進行深入探討。