臨床病理技術(shù)用于胸腔積液細(xì)胞塊中的臨床意義

張 羽

（遼陽市中心醫(yī)院病理科，遼寧 遼陽 111000）

胸腔積液主要由胸腔漿液重吸收功能或滲出功能障礙所引發(fā)，若胸腔漿液重吸收功能下降或滲出作用增強，均會導(dǎo)致漿液于胸腔內(nèi)集聚，從而導(dǎo)致胸腔積液形成[1]。近年來，胸腔積液發(fā)病率逐漸升高[2]。目前臨床最常見的胸腔積液主要為肺部感染或惡性腫瘤所致。依據(jù)積液性質(zhì)的不同，胸腔積液常被分為良性與惡性。良性胸腔積液通過常規(guī)胸腔抽水即可達(dá)到較好治療效果，患者預(yù)后較好；若胸腔積液為惡性則治療難度高，患者預(yù)后差[3]。因此臨床做好胸腔積液的早期檢查及鑒別診斷，對于改善患者預(yù)后具有重要臨床價值和社會意義。通常，典型胸腔積液的臨床特征明顯，診斷效率高，但對于早期積液量較少而無明顯癥狀，或積液位于肺底、葉間膜的積液及包裹性積液等位置不典型的情況，其臨床診斷較為復(fù)雜，為胸腔積液的診斷帶來了一定的困難。病理檢查是臨床診斷胸腔積液的常用方法[4]。常規(guī)細(xì)胞涂片法利用胸腔積液標(biāo)本制備細(xì)胞涂片，置于顯微鏡下檢查，是臨床診斷胸腔積液的傳統(tǒng)病理診斷方法，但其無法清晰鑒別漿膜腔內(nèi)的原發(fā)性間皮性腫瘤和已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥病變，對于胸腔積液診斷的敏感性較差（50%～78%）[5]。細(xì)胞塊免疫組化檢查法則利用胸腔積液制作細(xì)胞蠟塊，經(jīng)染色處理后置于顯微鏡下確診。為確定上述2種臨床病理技術(shù)的價值，本研究針對65例胸腔積液患者進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇于2018年9月至2019年10月在遼陽市中心醫(yī)院病理科確診的65例胸腔積液患者為研究對象。其中男36例，女29例；年齡14～78歲，平均（41.73±12.69）歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)相關(guān)檢查確診為胸腔積液；獲得合格的胸腔積液作為待檢樣本；均接受病理診斷；了解研究內(nèi)容，明確研究目的，且自愿簽署協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并全身免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾?。宦犝f能力異常，無法正常溝通。

1.3 方法 所有胸腔積液患者均接受常規(guī)細(xì)胞涂片法診斷及細(xì)胞塊免疫組化法診斷。

1.3.1 常規(guī)細(xì)胞涂片法診斷 ①獲取胸腔積液標(biāo)本。給予胸腔積液患者留置胸腔閉式引流管，留取適量胸腔積液，以備脫落細(xì)胞學(xué)檢查。②制片。于清潔容器內(nèi)置入50 mL新鮮胸腔積液標(biāo)本，將細(xì)胞采集器的濃縮器端軟管置于胸腔積液內(nèi)，抽吸胸腔積液（待抽吸吃力或抽完時停止），沿順時針方向打開濃縮器，沿?zé)o截留物面朝上方向，將濃縮器內(nèi)的膜片置于載玻片表面，反復(fù)拖動膜片，直至膜片表面的截留物停留于載玻片上。將涂片自然晾干，待邊緣稍干而中心處未干時，將其浸潤于95%乙醇溶液內(nèi)固定，持續(xù)固定15 min后，利用HE自動染色機行HE染色。將染色后的涂片置于顯微鏡下，由2名擁有豐富閱片經(jīng)驗的病理醫(yī)師閱片，判讀結(jié)果一致時，確診。

1.3.2 細(xì)胞塊免疫組化法進行診斷 ①獲取胸腔積液標(biāo)本。流程與常規(guī)細(xì)胞涂片法一致。②標(biāo)本預(yù)處理。將250 mL新鮮胸腔積液置于清潔容器內(nèi)，于室溫下持續(xù)靜置0.5 h。③離心。棄標(biāo)本上清液，取50 mL底層液體分別置于5個試管內(nèi)，按照2 000 r/min的速度，將試管持續(xù)離心10 min。離心合格的標(biāo)志為：試管經(jīng)離心處理后，底層可見沉淀。如試管內(nèi)的沉淀不足，可重復(fù)進行離心處理。④固定。棄上清液，吸出試管內(nèi)沉淀物，移入潔凈玻璃瓶內(nèi)。參照沉淀物體積向玻璃瓶內(nèi)混入適量10%濃度的中性緩沖福爾馬林固定液（固定液:沉淀物=10∶1），以吸管輕輕吹打沉淀物，以促進沉淀物的固定。于室溫下靜置12 h。⑤脫水。棄上清液，將細(xì)胞沉渣置入擦鏡紙（事先折成漏斗狀），利用吸水紙吸出細(xì)胞沉渣間隙的殘留液體。將擦鏡紙折成閉合狀，置于70%濃度的乙醇溶液中，持續(xù)脫水12 h。以吸水紙吸干后，改用80%濃度乙醇脫水（時間為1 h）；再次以吸水紙吸干，置于95%濃度乙醇中脫水1 h；以吸水紙吸干，置于無水乙醇內(nèi)最后進行1次脫水處理，吸干后即可完成細(xì)胞沉渣的脫水操作。⑥病理科染色前處理。選用LEICA EG 1150H型號石蠟包埋機進行石蠟包埋處理。將所制備的細(xì)胞蠟塊置于-24 ℃并向內(nèi)持續(xù)冷凍10 min。利用切片機進行切片。⑦免疫組化染色。選用0.3%濃度的過氧化氫溶液持續(xù)孵育細(xì)胞切片10 min（溫度37 ℃），隨后采用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。利用枸櫞酸鹽緩沖液針對細(xì)胞塊圖片進行高壓修復(fù)，噴氣后維持1.5 min，置于室溫下冷卻，以PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。采用羊血清工作液對高壓修復(fù)后的細(xì)胞切片進行封閉處理，持續(xù)封閉10 min（溫度37 ℃）。棄羊血清工作液，向細(xì)胞切片上滴加一抗，于4 ℃條件下孵育過夜。隨后采用PBS緩沖液進行沖洗（常規(guī)沖洗3次，每次5 min）。向細(xì)胞切片滴加生物素標(biāo)記二抗，置于37 ℃條件下持續(xù)孵育15 min，以PBS緩沖液常規(guī)沖洗。向試管內(nèi)滴加DAB溶液進行顯色處理，持續(xù)顯色2 min。采用蘇木精進行復(fù)染處理（時間為2 min），隨后以中性樹膠進行封閉、固定。⑧將染色后的細(xì)胞塊置于顯微鏡下觀察，結(jié)果的判讀參照常規(guī)細(xì)胞切片法標(biāo)準(zhǔn)完成。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察2種病理診斷方法下胸腔積液樣本中胞膜和胞質(zhì)中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、鈣結(jié)合蛋白（Ca-binding protein，CaBP）和細(xì)胞核中Wilm’s腫瘤細(xì)胞-1（Wilm's tumor cell-1，WT-1）表達(dá)情況，依此判定胸腔積液的陽性檢出率。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：①胞膜胞質(zhì)中CEA和CK7呈現(xiàn)為棕黃色，CaBP顯示出黃色。②細(xì)胞膜中CaBP顯示出黃色。③細(xì)胞核中WT-1染色為棕黃色，CaBP顯示出黃色。④所有間皮細(xì)胞或腺癌細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)占比＞10%[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果 常規(guī)細(xì)胞涂片法的鏡檢結(jié)果顯示：部分細(xì)胞涂片可清晰顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但仍存在部分細(xì)胞涂片厚度不均、涂片染色背景濃厚、局部細(xì)胞重疊、透明度偏低、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清等問題。細(xì)胞塊免疫組化檢查法的鏡檢結(jié)果顯示：細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核與胞質(zhì)染色對比突出，透明度較高，細(xì)胞厚度分布均勻，且染色背景清晰，細(xì)胞切片中保持部分組織學(xué)形態(tài)特征。

2.2 診斷結(jié)果 常規(guī)細(xì)胞涂片法診斷胸腔積液的準(zhǔn)確率明顯低于細(xì)胞塊免疫組化檢查法（P＜0.05）。

表1 不同方法的診斷結(jié)果比較[n（%）]

3 討 論

胸腔是胸腔壁層和臟層之間的間隙，在正常狀態(tài)下，胸腔中會有5～15 mL胸膜液發(fā)揮潤滑呼吸運動的作用。人體正常代謝所產(chǎn)生的500～1 000 mL的胸腔漿液會被吸收。若胸腔發(fā)生病理變化，導(dǎo)致胸膜部位毛細(xì)血管中靜水壓和胸膜通透性異常增大，毛細(xì)血管中交替滲透壓驟降、壁層胸膜淋巴液正?；亓鞒霈F(xiàn)障礙等發(fā)生，致使胸腔內(nèi)漿液的吸收功能下降，滲出作用增強，從而形成胸腔積液[7-8]。目前，胸腔積液已被證實為肺癌的常見合并癥[9]。既往臨床經(jīng)驗證實，多數(shù)胸腔積液患者的預(yù)后良好，但惡性胸腔積液患者則容易出現(xiàn)不良預(yù)后。50%～80%的以肺癌為病因的胸腔積液患者為惡性胸腔積液[10]。因此，判斷胸腔積液良惡性在臨床治療和預(yù)后改善方面具有重要的意義。

常用的胸腔積液檢查方法包括影像學(xué)檢查、經(jīng)皮胸膜穿刺活檢[11]、胸腔穿刺抽液檢查和病理學(xué)檢查等。其中胸部X線片和CT等影像學(xué)檢查方法可用于判斷胸腔積液（積液容量200 mL左右時影像學(xué)檢查肋膈角變鈍）[12]；胸部超聲科顯示胸膜壁層和臟層間為無回聲區(qū)[13]；胸腔穿刺抽液可用于胸腔積液中細(xì)胞數(shù)目定量和黏蛋白定性分析及治療效果的評價方面[14]；病理診斷是臨床診斷胸腔積液的主要方法，在未完全明確胸腔積液起病原因的情況下，對患者實施病理檢查，有助于診斷疾病[15]。臨床醫(yī)師應(yīng)選擇適宜的鑒別診斷技術(shù)對胸腔積液病情進行診斷，以明確病情，為后續(xù)治療方案確定提供科學(xué)依據(jù)。胸腔積液患者診斷的困難性在于：當(dāng)胸腔積液患者的積液量≤0.5 L時，通常無明顯癥狀；而當(dāng)積液量超出0.5 L標(biāo)準(zhǔn)時，可產(chǎn)生呼吸困難、心悸等表現(xiàn)。上述特征限制了常規(guī)癥狀評估、體格檢查在胸腔積液診斷中的應(yīng)用。

常規(guī)細(xì)胞涂片法的應(yīng)用原理為：從胸腔積液患者的胸腔積液標(biāo)本中獲取脫落細(xì)胞，制作細(xì)胞涂片，置于顯微鏡下，觀察細(xì)胞大小及形態(tài)，以確定診斷結(jié)果[16]。這種檢查方法的制片操作較為簡單，整個過程的耗時較短，且對胸腔積液患者產(chǎn)生的損傷較小。細(xì)胞塊免疫組化檢查法作為一種新型病理技術(shù)，主要通過采集患者的漿膜腔積液、離心處理獲得細(xì)胞沉淀物、固定、脫水、切片、染色處理后，置于顯微鏡下觀察，判定診斷結(jié)果[17]。

在胸腔積液診斷中，細(xì)胞塊免疫組化法檢查的應(yīng)用優(yōu)勢體現(xiàn)為：①制片質(zhì)量高。采用常規(guī)細(xì)胞涂片法制片，將細(xì)胞涂片置于顯微鏡下檢查，容易發(fā)現(xiàn)細(xì)胞重疊、細(xì)胞染色背景濃厚、厚度不均及透明度低下等問題[18]。而相比之下，細(xì)胞塊免疫組化檢查法則可有效改善制片質(zhì)量。本研究證實：采用細(xì)胞塊免疫組價病理檢查法制片，胸腔積液患者的細(xì)胞制片染色背景清晰，細(xì)胞厚度均勻，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，組織學(xué)形態(tài)特征保持良好。這一優(yōu)勢為這種病理技術(shù)的普及應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。②可長期保存。經(jīng)常規(guī)細(xì)胞涂片法制片，所得細(xì)胞涂片需于較短時間內(nèi)進行鏡下檢查，隨著細(xì)胞涂片留置時間的延長，涂片中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、數(shù)量均可能出現(xiàn)變化，進而影響鏡檢結(jié)果的可靠性。而細(xì)胞塊免疫組化檢查法則直接將胸腔積液中的細(xì)胞利用脫水、固定等處理技術(shù)，制成細(xì)胞蠟塊。相對于細(xì)胞涂片而言，細(xì)胞塊標(biāo)本的穩(wěn)定性較強，可長期保存。當(dāng)需要進行病理檢查時，可隨時切片，而無須擔(dān)憂細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量受損。細(xì)胞塊免疫組化檢查法的這一優(yōu)勢，可為胸腔積液患者的臨床病理診斷工作帶來諸多便捷。③診斷結(jié)果可靠。診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性是評估臨床病理技術(shù)價值的主要因素。本研究結(jié)果提示，細(xì)胞塊免疫組化檢查法的診斷準(zhǔn)確率高于常規(guī)細(xì)胞涂片法（P＜0.05）。分析形成上述差異的原因可能為：經(jīng)常規(guī)細(xì)胞涂片法制備的細(xì)胞標(biāo)本質(zhì)量欠佳，如涂片中的腫瘤細(xì)胞缺乏典型性，可能會被誤診為間皮細(xì)胞，進而影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性；采用常規(guī)細(xì)胞涂片法診斷胸腔積液時，細(xì)胞涂片標(biāo)本可能受到多種因素的影響。當(dāng)細(xì)胞涂片中存在炎性細(xì)胞或受到細(xì)胞退變因素影響時，機體間皮細(xì)胞容易受上述影響而出現(xiàn)形態(tài)改變，增加誤診風(fēng)險（將正常間皮細(xì)胞誤診為腫瘤細(xì)胞）。而組織塊免疫組化檢查法則針對常規(guī)細(xì)胞涂片法的不足加以改進，該方法將胸腔積液患者的積液離心細(xì)胞沉淀物制備成石蠟細(xì)胞塊，利用固態(tài)細(xì)胞塊進行切片，可確保細(xì)胞結(jié)構(gòu)的清晰度，且保留部分組織形態(tài)學(xué)特征，進而保障胸腔積液診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。④耗材少。采用細(xì)胞塊免疫組化法進行診斷時，整個診斷流程僅消耗少量甲醛緩沖液、枸緣酸緩沖液、羊血清工作液及石蠟等材料，檢查過程中的耗材較少，成本相對較低。對于胸腔積液患者而言，這一優(yōu)勢決定著胸腔積液患者對細(xì)胞塊免疫組化檢查法的接受度較高，采用該方法進行診斷，不易增加患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

雖然細(xì)胞塊免疫組化法較常規(guī)細(xì)胞涂片法具備較多優(yōu)勢，但采用該方法診斷胸腔積液時，仍然可能會面臨一定的漏診、誤診問題。分析經(jīng)細(xì)胞塊免疫組化法診斷胸腔積液漏診、誤診的原因可能為：①細(xì)胞遺失。在按照細(xì)胞塊免疫組化檢查法流程進行轉(zhuǎn)移細(xì)胞沉淀物、固定、脫水等常規(guī)處理時，可能有部分細(xì)胞遺失，進而影響最終診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。②細(xì)胞缺乏異型性。部分細(xì)胞缺乏異型性，容易被誤診為間皮細(xì)胞。③細(xì)胞含量不足。以胸腔閉式引流法采集胸腔積液患者的積液時，部分患者的胸腔積液呈透明狀，內(nèi)部細(xì)胞含量較少，容易增加誤診、漏診風(fēng)險。

在采用細(xì)胞塊免疫組化法診斷胸腔積液時，為確保這種病理技術(shù)作用的充分發(fā)揮，需加強對以下問題的重視：①固定時間控制。在細(xì)胞塊免疫組化檢查中，細(xì)胞沉淀物的固定時間是影響最終診斷結(jié)果的關(guān)鍵所在。采用固定液（甲醛緩沖液）進行固定時，如固定時間過長，容易造成蛋白、細(xì)胞的過度吸收，引發(fā)細(xì)胞形態(tài)改變，進而影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性；如果固定時間不足，則容易導(dǎo)致固定不充分，也可能干擾診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。對此，在利用這種病理技術(shù)進行診斷時，需注意將胸腔積液患者的細(xì)胞沉淀物固定時間控制于12 h左右，以確保固定時間的合理性。②離心處理。結(jié)合細(xì)胞塊免疫組化檢查法的應(yīng)用經(jīng)驗來看，不同類型胸腔積液患者的細(xì)胞塊制作成功率存在一定差異。相對于胸腔積液呈透明狀的患者而言，胸腔積液較為渾濁者或血性胸腔積液患者的細(xì)胞塊制作成功率較高。為保障細(xì)胞塊免疫組化檢查過程的效率，可于前期胸腔積液采集、離心處理環(huán)節(jié)，預(yù)先采集多份胸腔積液標(biāo)本，并針對多份標(biāo)本進行離心處理，以確保胸腔積液透明者可成功制作細(xì)胞蠟塊[19]。

綜上所述，胸腔積液診斷中宜推行細(xì)胞塊免疫組化法檢查，以保障鏡檢下細(xì)胞質(zhì)量，并保障診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。