高危型人乳頭瘤病毒E6/E7基因在未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞分流中的應用效果

黃梅秀 謝芳 林艷華 陳嵐嵐 李微微

（福建醫科大學附屬閩東醫院婦科，福建 福安 355000）

近半個世紀以來，宮頸細胞學檢測已廣泛應用于宮頸癌篩查，其中意義不明的非典型磷狀細胞（ASCUS）在細胞學異常中占50%以上，大部分的ASCUS和低級別病變可自發性消退[1]。細胞學ASC-US中最終被診斷高級別病變為5.10%～9.00%。目前，已經確定了100多種人類乳頭瘤病毒，包括13種高危類型，它們會導致宮頸癌和其他肛門生殖器和口咽癌，人類乳頭瘤病毒16型和18型約占所有宮頸癌的70%[2]。因此HPV檢測成為管理女性ASCUS的主要方法，這種方法被ASCCP指南推薦。據報道，在出現ASCUS的女性中有15%～20%在隨后的組織學診斷中被確定為宮頸上皮內瘤樣病變（CIN）2級及以上（CIN2+）[3]。5年隨訪結果也表明，出現ASCUS的女性患宮頸上皮內瘤樣病變3級及以上（CIN3+）的風險顯著高于一般人群。然而，若將ASCUS的女性全部轉診陰道鏡，則存在過度診斷的問題。ASCCP建議對宮頸細胞學結果為ASCUS的患者進行HPV檢測。目前的管理指南不推薦患有ASCUS的女性進行HPV基因分型。本研究中，我們以宮頸癌篩查人群為研究對象，通過比較Aptima HPV（AHPV）和Aptima HPV16/18/45 Genotype（AHPV-GT）檢測對細胞學診斷為ASCUS患者的分流效果，探討二者用于 ASCUS人群分流的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 參與人群 本數據為回顧性分析本院2019年6月至2021年6月期間細胞學檢測為ASCUS的女性，符合條件的女性為21歲或以上，并有ASCUS細胞學檢查結果。如果孕婦、曾報告曾接種過HPV疫苗、有宮頸疾病（癌癥或癌前病變）史或在過去12個月細胞學檢查結果異常（ASCUS，低級別鱗狀上皮內病變，或更糟），或有可能干擾研究或對參與者造成不可接受風險的病史者則排除在研究之外。本研究獲得福建醫科大學附屬閩東醫院倫理委員會的批準，編號為[2020]寧閩醫倫理審字第（0820-02號）。參加宮頸癌篩查者中細胞學診斷為ASCUS共397例，其中有完整陰道鏡召回信息及AHPV檢測結果陽性的女性作為研究對象，共239例。

1.2 材料與方法 回顧性分析2019年6月至2021年6月在福建醫科大學附屬閩東醫院婦科門診就診，細胞學結果為ASCUS的有性生活史女性。均自愿接受HPV Aptima HPV檢測及（Aptima HPV-GT）。

1.3 方法

1.3.1 試驗標本采集 醫師用采樣刷收集1份宮頸細胞標本，進行TCT+AHPV及AHPV-GT檢測。具體如下：取宮頸刷于宮頸管內順時針方向旋轉3圈，置入專用細胞保存液內，送病理科進行AHPV及AHPV-GT和TCT檢測。由工作人員給每個標本編號、送檢。

1.3.2 試驗檢測

1.3.2.1 液基細胞學檢測 將保存液中的部分標本經ThinPrep 2000系統程序化處理后，制成直徑為2 cm的薄層細胞涂片，95%酒精固定，巴氏染色。采用TBS分級系統進行細胞學診斷，診斷結果包括無上皮內病變或惡性病變（NILM）、ASCUS、非典型鱗狀細胞、不除外高級別鱗狀上皮內病變、不典型腺細胞、低度鱗狀上皮內病變、高度鱗狀上皮內病變、鱗癌、原位腺癌和腺癌。液基細胞學檢測結果為NILM時定義為正常。

1.3.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 采用Gen-Probe Technologyand PANTHER System進行檢測。該系統主要基于多重核酸擴增體系，可檢測包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68型在內的共14種高危型。主要包括mRNA的提取、擴增和擴增產物檢測。提取出的mRNA通過轉錄介導擴增技術（TMA）法進行擴增，TMA法是利用小鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶和T7核糖核酸聚合酶而進行的以反轉錄為基礎的核酸擴增方法。MMLV反轉錄酶可催化含有T7核糖核酸聚合酶啟動子序列的mRNA反轉錄為cDNA，進而在T7核糖核酸聚合酶作用下，以反轉錄的cDNA為模板進一步合成DNA完成mRNA的擴增。擴增后的產物通過人類血小板抗原法進行檢測，該方法利用熒光探針特異性與擴增產物雜交，選擇劑淬滅未雜交探針上的熒光以區分雜交和未雜交探針，光度計測量雜交混合物上的熒光光量子，通過分析物的信號與截點比值來進行結果判定。

1.3.2.3 Aptima HPV-GT檢測 對Aptima HPV檢測陽性的標本，進一步采用Aptima HPV-GT檢測試劑盒對HPV 16型和HPV 18/45型進行分型檢測，具體步驟按照其說明書進行操作，由儀器自動檢測4 h后查看檢測結果。Aptima HPV檢測陰性的標本視為Aptima HPV-GT檢測陰性。

1.3.2.4 陰道鏡檢查及活檢 宮頸充分顯露后，使用4%醋酸溶液涂抹整個宮頸，全面觀察后用碘液涂抹，再經充分觀察，對白色病變、點狀血管、碘不著色等可疑病變部位行多點取樣及宮頸搔刮術。采集的活檢組織使用甲醛固定處理，送至病理科進行活檢：標本經脫水、組織包埋、切片、染色、封片后，由2位專業的病理診斷醫師進行閱片診斷，診斷結果描述采用世界衛生組織三級分類法，分為無病變或炎癥（NILM）；低度鱗狀上皮內瘤變（LSIL）包含CIN1和（或）宮頸濕疣；高度鱗狀上皮內瘤變（HSIL）包含CIN2和（或）CIN3；癌（Ca）4組。

1.3.3 質量控制 對工作人員進行統一培訓，婦科檢查和陰道鏡檢查醫師均有豐富的臨床工作經驗。細胞學診斷和病理學診斷均由福建醫科大學附屬閩東醫院具有多年工作經驗的醫師完成。在研究開始前，召開陰道鏡培訓會和組織病理閱片會，統一病理判讀標準。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析；計數資料以率表示，采用χ2檢驗比較Aptima HPV檢測和TCT檢查對組織學診斷≥HSIL的篩查價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染與年齡關系 本研究參與者的平均年齡（47.51±12.39）歲（26～84歲）。該人群HPV16陽性率為13.56%（32/236），HPV18/45陽性率8.47%（20/236），HPV16、18/45陽性率1.27%（3/236）。不同年齡段的HPV陽性率79.55%（20～30歲），56.70%（31～40歲），55.70%（41～50歲），53.97%（51～60歲），70.73%（≥61歲）（圖1）。HPV感染率呈雙峰型趨勢，30歲以下達高峰，61歲之后再次升高。不同年齡組的HPV感染率差異有統計學意義（χ2=25.30，P＜0.0001）。

圖1 HrHPV陽性ASCUS病例流程圖

2.2 HPV檢測流程 本研究中TCT為ASCUS，AHPV陽性者共236例，其中失訪人員（未進行陰道鏡檢查）為64例，占27.12%。進行陰道鏡活檢患者為172例。在AHPV-GT陽性者中HSIL占36.17%（17/47），宮頸癌占4.26%（2/47）。而AHPV-GT陰性者中HSIL占19.20%（24/125），宮頸癌占2.40%（3/125），二者差異具有統計學意義（χ2=5.906；P=0.0151）。AHPV-GT陽性患者中，HPV16、18/45均陽性患者3例，其中2例行陰道鏡活檢，病理結果皆為CIN2+，比例為1.16%（2/172）、100.00%，HPV16 陽性為6.40%（11/172），HPV 18/45陽性為3.49%（6/172）。見表1。

表1 ASCUS患者HPV感染與年齡的關系

表1 陰道鏡檢查ASCUS/HPV陽性女性細胞學結果

2.3 ASCUS/AHPV-GT陽性對比ASCUS/AHPV-GT陰性 病理結果為NILM（χ2=0.386，P=0.621）、CIN1（χ2=2.788，P=0.095）、CIN2（χ2=1.038，P=0.308）的發病率上無顯著差異。其中ASCUS/AHPV-GT陽性時CIN2+、CIN3+、宮頸癌發病率分別為40.5%、23.5%、4.3%，而ASCUS/AHPV-GT陰性患者該發病率相應為21.6%、10.4%、2.4%。CIN2+（χ2=4.811，P=0.028）、CIN3+（χ2=6.179，P=0.013）發病率差異具有統計學意義。

3 討論

3.1 宮頸癌是一種眾所周知的、可預防的惡性腫瘤。ASCUS是一個模糊的術語，是一種排除性診斷，提示有疾病風險，而不是異常病變的明確診斷。對于有ASCUS的女性，如果診斷不明確或不及時，會延誤最佳治療；另外，過度的診治不僅會給婦女帶來身體和心理上的負擔，還會造成不良的妊娠結局[4]。對于ASCUS的細胞學處理的目的是發現可能出現高級別病變甚至潛在宮頸癌的患者[5]。然而，對于這些情況，沒有一種全球可接受的戰略。對于ASCUS的處理包括重復細胞學檢查、陰道鏡檢查和（或）HPV檢測。ASCCP建議對宮頸細胞學結果為ASCUS的患者進行HPV檢測，如果HPV檢測結果呈陽性，則建議進行陰道鏡檢測[6]。如果HPV檢測結果為陰性，則建議在3年隨訪時進行重復檢測。如果無法進行HPV檢測，則可在1年后再次進行細胞學評估，如果重復細胞學檢查再次發現ASCUS，建議進行陰道鏡檢查[7]。

3.2 在本研究中，如果ASCUS/HPV陽性，則對所有轉至本研究診所的患者進行陰道鏡檢查。本研究表明，細胞學為ASCUS女性中，HPV感染率與年齡呈雙峰型趨勢，HPV感染高峰出現在30歲以下，隨年齡增長逐漸下降，到中年處于平臺期，61歲后開始逐漸升高。而從全球數據來看，HPV感染高峰出現在25歲以下，隨年齡增長逐漸下降，到中年處于平臺期，65歲后略有上升。我們數據與全球數據趨勢相似。我們發現的兩個峰值模式可能部分歸因于HPV感染的自然史[8]。

3.3 目前的管理指南不推薦患有ASCUS的女性進行HPV基因分型[9]。然而，由于HPV 16相關的宮頸疾病風險非常高，即使在陰道鏡檢查時沒有發現病變，HPV 16陽性的女性在未來發展為宮頸疾病的風險更高。本研究中ASCUS/HPV陽性患者中，HPV16陽性率為13.56%（32/236），且CIN2+檢出率39.29%（11/28）。HPV18/45陽性率8.47%（20/236），CIN2+檢出率35.29%（6/17）。HPV16、18/45陽性率1.27%（3/236），CIN2+檢出率100.00%（2/2），失訪1例，ASC-US/AHPV-GT陽性CIN2+及CIN3+檢出率明顯高于ASCUS/AHPV-GT陰性，具有統計學意義（χ2CIN2+=4.811，P=0.028；χ2CIN3+=6.179，P=0.013）。ASCUS患者進行HPV16、18/45分型是有意義的。

3.4 在中國，近一半被診斷為侵入性宮頸癌的女性從未接受過篩查，另外一部分癌癥病例發生在過去5年未被追蹤的女性中[10]。本研究失訪率達27%，可能與該研究為福建一少數民族占多數的欠發達地區，民眾對相關知識的匱乏、經濟文化水平等相關。對細胞學為ASCUS，HPV16、18/45均陽性患者可考慮進行快速治療。對AHPV-GT積極治療，特別是欠發達的農村地區，減少宮頸高級別以上病變的失訪[11]。隨著基因分型分析的出現，可以識別出更多的個體高危型HPV基因型，基于風險的管理指南可能會更新[12-15]。

3.5 作為一項回顧性觀察分析，我們對數據的解釋存在一定的局限性，如對實際有細胞學和hrHPV結果以及隨訪活檢結果的女性數據的選擇偏倚。因此，我們的研究更有可能反映現實世界的實踐。未來的研究將集中在使用更新的HPV檢測方法的相對優勢上，這些方法可以提高宮頸高級別病變檢測的特異性，從而為女性提供最有效的宮頸癌篩查策略。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA可用于 ASCUS人群分流。基于本次研究和其他國內外研究結果，建議采用HPV E6/E7 mRNA檢測對ASCUS人群分流同時進行AHPV-GT檢測，如HPV E6/E7 mRNA檢測陽性，患者可直接轉診陰道鏡檢查，且密切隨訪；若HPV16、18/45均陽性患者可考慮進行快速治療，如HPV E6/E7 mRNA檢測陰性，臨床醫師觀察宮頸處無異常，可以按照篩查指南，再次納入常規的宮頸癌篩查人群進行隨訪。