上尿路上皮癌腫瘤出芽與腫瘤相關中性粒細胞及患者預后的相關性研究

李光影 楊靜

上尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）是一種非常罕見的惡性腫瘤，且男性發病率高于女性[1]。目前對于治療上尿路上皮癌的方法是腎輸尿管切除、膀胱袖狀切除加淋巴結清掃、術后膀胱灌注，但術后復發率高，預后較差。目前上尿路上皮癌評估預后的指標為脈管癌栓、遠處轉移等常規指標，這已不能滿足臨床醫生對患者預后的評估，患者術后復發率及死亡率仍然較高，上尿路上皮癌需要更多可以提供早期診斷和評估預后的指標，因此探索上尿路上皮癌預后的特異性指標尤為重要[2]。

腫瘤出芽（tumor budding，TB）是指存在于惡性腫瘤的浸潤邊緣，散在的獨個腫瘤細胞或≤4 個腫瘤細胞的細胞群。腫瘤出芽具有上皮-間充質轉化的特點，它在惡性腫瘤早期的進展和轉移中起著不可或缺的作用[3-4]。研究顯示，腫瘤出芽還與結直腸癌、胃腺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等不良預后相關[5-10]。但是，腫瘤出芽在上尿路上皮癌中的研究鮮少，腫瘤出芽與上尿路上皮癌主要臨床病理變化特征的關系，腫瘤出芽與上尿路上皮癌免疫微環境的關系，腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者預后的關系都還未知。

在腫瘤微環境中，分布著一定數量的嗜中性粒細胞，它們在腫瘤微環境的維持及腫瘤進展中扮演了重要的“角色”[11]。腫瘤微環境中的嗜中性粒細胞通過分泌各種酶類物質、細胞因子及形成胞外網狀結構等，促進腫瘤細胞的生長及侵襲，即腫瘤相關中性粒細胞（TANs）[12-13]。研究表明TANs 還與膀胱尿路上皮癌、結直腸癌等的進展有關[14-17]。但TANs 與上尿路上皮癌患者預后的關系，腫瘤出芽與TANs 之間的關系還不明確。本研究通過探討腫瘤出芽與上尿路上皮癌主要臨床病理特征，腫瘤出芽和TANs 之間的關系，腫瘤出芽和TANs 與上尿路上皮癌患者預后的關系，以期為評估上尿路上皮癌患者的預后提供可靠的指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2016 年1 月-2020 年4 月錦州醫科大學附屬第一醫院85 例手術切除上尿路上皮癌患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、腫瘤部位、pT 分期、組織學分級、腫瘤大小、脈管癌栓及神經侵犯等。納入標準：（1）均經病理診斷為上尿路上皮癌；（2）所有患者術前均未接受放療或化療；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）合并膀胱癌；（2）既往有膀胱癌病史；（3）既往有其他腫瘤史；（4）術后30 d 內死亡。男51 例，女34 例；年齡45～89 歲，中位年齡為67 歲。所有患者術后均經電話的方式進行隨訪，術后第1 天開始隨訪，2 年內每3 個月隨訪1 次，2 年后每6 個月隨訪1 次，中位隨訪時間為23 個月（2～54 個月）。以患者復發、轉移、死亡或隨訪截止日期2020 年10 月為截止點，在隨訪過程中失訪或腫瘤未進展患者作為終點數據處理。本研究通過電話的方式獲得了所有患者的知情同意，并得到了本院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤出芽的判讀 腫瘤出芽的評估標準參照2020 版結直腸癌診療指南中腫瘤出芽共識，定義為200 倍鏡下存在于惡性腫瘤的浸潤邊緣，散在的獨個腫瘤細胞或≤4 個腫瘤細胞的細胞群，分級標準為0～4 個腫瘤出芽為低級別、5～9 個腫瘤出芽為中級別、≥10 個腫瘤出芽為高級別[18]。在高倍鏡視野（HPF）（×200）下，選取視野中最多數量的腫瘤出芽為最終數量。

1.2.2 免疫組織化學結果判定 使用購于Abcam 公司用于標記TANs 的CD66b 抗體，通過全自動免疫組化染色機染色經福爾馬林固定常規石蠟包埋4 μm 切片制成的85 例患者的病理切片，被抗體標記的TANs 其主要著色于細胞膜和細胞質，呈黃褐色。由兩名病理科醫生經免疫組化染色聯合HE切片觀察TANs 數量，TANs 分為上皮TANs 和間質TANs，但是筆者發現上皮中的TANs 數量和腫瘤中心間質中的TANs 數量太少，所以筆者在400 倍鏡下觀察腫瘤浸潤前沿間質TANs 數量，選取TANs最多的三個視野，求其平均值。浸潤前沿（invasive tumor front，ITF）定義為腫瘤與正常組織或器官的交界區域，在腫瘤浸潤邊緣和鄰近的非腫瘤性纖維脂肪基質之間的寬度約為1 mm[19]。

1.3 統計學處理 數據使用SPSS 21.0 進行處理分析，應用χ2檢驗分析腫瘤出芽水平與上尿路上皮癌臨床病理特征的關系。采用Spearman 法探索TANs與腫瘤出芽的關系。Kaplan-Meier 進行生存分析，采用log-rank 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 上尿路上皮癌組織中腫瘤出芽及浸潤前沿間質TANs 浸潤情況 根據出芽共識，將85 例患者分為低-中級別出芽組和高級別出芽組。其中低-中級別出芽組72 例，高級別出芽組13 例。

在上尿路上皮癌浸潤前沿間質中400 倍鏡下觀察到TANs 最多的三個視野并求其平均值，作為該病例TANs 的最終值，將所有病例的最終TANs數再平均，將平均值作為臨界值（平均值為16），≤16 為低TANs 組，＞16 為高TANs 組。上尿路上皮癌85 例患者，50 例為低TANs 組，35 例為高TANs 組。見圖1。

圖1 鏡下腫瘤出芽和TANs

2.2 上尿路上皮癌腫瘤出芽情況與上尿路上皮癌臨床病理特征的相關性 通過對腫瘤出芽情況與上尿路上皮癌患者臨床病理特征的研究發現，低-中級別出芽組和高級別出芽組患者的性別、pT 分期、腫瘤轉移、脈管癌栓及神經侵犯情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。低-中級別出芽組和高級別出芽組患者的年齡、腫瘤部位、組織學分級、腫瘤大小及復發情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同腫瘤出芽級別與上尿路上皮癌患者臨床病理的比較[例（%）]

表1 （續）

表1 （續）

進一步使用Spearman 法研究腫瘤出芽情況與TANs 水平之間的聯系，發現腫瘤出芽情況與TANs的水平呈正相關（rs=0.215，P=0.048）。見表2。

表2 腫瘤出芽與TANs之間的關系（例）

2.3 上尿路上皮癌腫瘤出芽水平與患者預后的關系 經隨訪后，共有23 例患者死亡，其中低-中級別腫瘤出芽組中有16 例死亡，高級別腫瘤出芽組中有7 例死亡。進行生存分析后發現，低-中級別出芽組總存活率為77.8%（56/72），高級別出芽組總存活率為46.2%（6/13）。兩組總存活率比較，差異有統計學意義（χ2=6.710，P=0.010），見圖2A。共有31 例患者疾病進展，低-中級別腫瘤出芽組中有22 例疾病進展，高級別腫瘤出芽組中有9 例疾病進展。進行生存分析后發現，低-中級別出芽組無病生存率為69.4%（50/72），高級別出芽組為30.8%（4/13）。兩組無病生存率比較，差異有統計學意義（χ2=10.334，P=0.001），見圖2B。共有16 例患者因此病死亡，低-中級別腫瘤出芽組中有10 例因此病死亡，高級別腫瘤出芽組中有6 例因此病死亡。進行生存分析后發現，低-中級別腫瘤出芽組患者腫瘤特異生存率為86.1%（62/72），高級別腫瘤出芽組患者腫瘤特異生存率為53.8%（7/13）。兩組腫瘤特異生存率比較，差異有統計學意義（χ2=7.809，P=0.005），見圖2C。

圖2 Kaplan-Meier腫瘤出芽生存曲線圖

2.4 上尿路上皮癌TANs 水平與患者預后的關系 經Kaplan-Meier 分析，低TANs 組36 例無疾病進展，無病生存率為72.0%（36/50），高TANs 組患者無疾病進展18 例，無病生存率為51.4%（18/35）。兩組無病生存率比較，差異有統計學意義（χ2=8.113，P=0.004）。低TANs 組和高TANs 組總存活率、癌癥特異生存率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 Kaplan-Meier腫瘤出芽生存曲線圖

3 討論

本研究通過評估腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者主要臨床病理特征變化及預后之間的關系，發現相對于低-中級別出芽組，高級別出芽組患者多為男性、pT 分期較高、腫瘤容易轉移、脈管癌栓及神經侵犯常見，預后較差；高TANs 水平患者的無病生存率低。筆者進一步研究了腫瘤出芽與腫瘤微環境中TANs 的關系發現，腫瘤出芽情況與TANs 水平呈正相關，即腫瘤出芽數量越多的患者TANs 水平越高，提示腫瘤出芽與TANs 之間可能存在某種關聯，使之相互作用，進而影響上尿路上皮癌患者的預后。

既往研究證實，腫瘤出芽與結直腸癌、胃腺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等不良預后相關[5-10]。腫瘤出芽具有上皮間質轉化的特征，它在惡性腫瘤早期的進展和轉移中起著不可或缺的作用。而惡性腫瘤的轉移不是單一的過程，是通過多種炎癥細胞、細胞因子、各種信號通路等協作完成的，而這種協作又與腫瘤微環境息息相關。

目前有關上尿路上皮癌中腫瘤出芽的研究很少，僅有少數文獻報道了腫瘤出芽與上尿路上皮癌臨床病理特征及與患者預后的關系。Kawamura 等[20]發現高腫瘤出芽與輔助化療狀態、高病理T 分期、淋巴管浸潤、淋巴結轉移、腫瘤部位有關，多變量Cox 分析顯示淋巴侵犯和高腫瘤出芽是尿路上皮癌復發的獨立預測因子，高腫瘤出芽也是總生存率的獨立影響因素。本研究收集了85 例患者臨床資料及病理切片，發現腫瘤出芽與男性、高pT 分期、遠處轉移、多脈管癌栓和多神經浸潤有關，但與年齡、部位、組織學分級、腫瘤大小及復發無關。

既往也鮮少有研究報道腫瘤出芽與上尿路上皮癌患者預后的關系，目前僅發現一篇，而其對腫瘤出芽的評估方法是在200 倍鏡下，選取視野下最密集的腫瘤出芽數量，若TB 數量≥10 個為高腫瘤出芽，反之則為低腫瘤出芽，用這樣的方法對腫瘤出芽與患者預后的關系進行評估[20]。本研究參照2020 版結直腸癌診療指南中腫瘤出芽共識，在顯微鏡下觀察HE 病理組織切片，根據出芽共識對腫瘤出芽進行分級，分為低-中級別腫瘤出芽組和高級別腫瘤出芽組[18]。采用Kaplan-Meier 方法進行單因素生存分析和log-rank 檢驗，發現高級別腫瘤出芽上尿路上皮癌患者的預后較差，因此筆者推測腫瘤出芽可作為一個預測上尿路上皮癌患者預后的新指標。

筆者通過生存分析發現，上尿路上皮癌TANs作為腫瘤免疫微環境中的重要組成部分，與上尿路上皮癌患者預后相關，即較低的TANs 水平伴隨著患者較高的無病生存期。近年來，腫瘤免疫微環境在腫瘤發生發展中的作用越來越受到重視。其中，間質內的TANs 是腫瘤免疫微環境的重要組成部分，是機體應對腫瘤產生反應的重要機制，TANs的數量能夠在一定程度上反映機體對腫瘤的反應程度[21]。本研究發現上尿路上皮癌浸潤前沿間質中的TANs 水平與患者較低的無病生存率有關，而既往無有關TANs 水平與上尿路上皮癌患者預后關系的報道。

在本研究中，筆者發現，腫瘤出芽的水平與浸潤前沿間質TANs 的數量呈正相關，即腫瘤出芽數量越多的患者，浸潤前沿間質TANs 數量越多，預后較差；腫瘤出芽越低的患者，浸潤前沿間質TANs 數量越低，預后較好。提示上尿路上皮癌腫瘤出芽與浸潤前沿間質TANs 相互作用，從而調控上尿路上皮癌的發展，影響患者預后。然而腫瘤出芽與TANs 之間的相互作用機制還未明確。有研究發現，腫瘤出芽的主要特征是上皮-間質轉化，在腫瘤出芽上皮間質轉化的過程中可引起腫瘤微環境的某些變化，如會產生和提高一些促腫瘤因子水平，如轉化細胞生長因子、肝細胞生長影響因子、表皮生長因子等；而腫瘤微環境中的少氧狀態、細胞因子、其他炎癥細胞、炎癥介質等又影響著腫瘤出芽的產生和上皮間質轉化的過程[22-24]。而本研究發現在上尿路上皮癌中腫瘤出芽情況與微環境中的TANs 水平呈正相關，提示腫瘤出芽與TANs 之間可能通過某種信號通路、細胞因子聯系在一起，但具體的細節還需繼續深入探索。

綜上所述，本研究發現上尿路上皮癌腫瘤出芽情況與浸潤前沿間質TANs 呈正相關，表明了腫瘤細胞出芽和TANs 與上尿路上皮癌臨床主要病理變化特征及預后的關系，為上尿路上皮癌診治研究提供了潛在的指標。但腫瘤出芽與TANs 的判讀尚缺乏統一標準，因此，兩者是否能夠用于臨床還需更多的研究。