側流免疫層析技術的研究進展

黃正壯

(南寧市第一人民醫院，南寧 530016)

0 引言

傳統的實驗室分析方法包括氣相色譜-質譜(GC-MS)、超高效液相色譜-串聯質譜(LC/MS/MS)、高壓液相色譜(HPLC)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)和生物傳感器等，其大多敏感性好但耗時長，需要昂貴的儀器設備和專業人員[1]。過去的幾十年里，科學研究重點越來越多的放在開發和優化便攜、廉價、易用的快速診斷實驗上[2]。而免疫化學生物分析方法因其高度的特異性和靈敏性備受關注。目前，大多數篩查和快速方法都是基于免疫分析。該方法基于分析物/抗原(Ag)與選擇性抗體(Ab)反應，形成Ab-Ag復合物。免疫分析的有效性主要取決于抗體-Ag復合物形成的效率和檢測復合物的形成速度[3]。

側流免疫層析技術(lateral flow immunoassay，LFIA)是迄今為止對目標物質進行現場檢測最成功的分析平臺之一，檢測速度快，簡單易用，價格低廉，應用廣泛，已從用于臨床分子、生物體和(生物)標志物檢測擴展到其他領域，包括食品和飼料安全、獸醫、環境控制諸多領域。LFIA具有快速、簡便、易讀、現場適用性好、保質期長、所需體積小、生產成本相對較低、靈敏度和特異度好、可與電子和電化學系統集成等優點[4]，適用于檢測多種樣本類型，可以在15 min內完成檢測，通過對抗體、標記劑和運行緩沖液等試劑進行優化。LFIA設備可以在室溫下儲存至少2年，非常適合在資源有限的條件下使用[5]。

1 LFIA的基本組成

LFIA由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙組成，其按順序固定于背板上面，組成測試試紙條[6]。

樣品墊作為反應的起始點，主要起到加載樣品的作用，材料一般為聚酯纖維膜或玻璃纖維膜。為保證樣品墊能屏蔽樣品內非目標基質對目標基質的檢測干擾，處理不同標本時，根據標本的不同，通常需要不同的預處理液對樣品墊進行預處理。

金標結合墊一般由吸水性和均一性良好的玻璃纖維、無紡布或聚酯纖維制成，根據使用要求的不同，對結合墊的材料、厚度、釋放速度和浸泡前處理進行調整，以保證結合物的結合穩定性及持續均勻地遷移至硝酸纖維素膜上。

硝酸纖維素膜是整個試紙條的檢測區域，根據檢測樣品的不同，可以在硝酸纖維素膜上包埋不同的抗原或檢測抗體對樣品進行檢測。不同孔徑和不同液體遷移速度的硝酸纖維素膜有不同的特性，可以根據實驗需要進行選擇。

吸水墊主要用于吸收廢液，一般由性能穩定、吸水量大、吸水性能好的吸水紙制作而成。

襯板主要用于對各個組成部分的支撐和組裝，一般由PVC材料制成[7]。

圖1 膠體金免疫層析試紙條結構圖Fig.1 Structural diagram of colloidal gold immunochromatographic test strips

如圖1所示，T檢測線與C質控線固定在硝酸纖維素膜上，金標結合墊固定了納米標記物，當樣品滴加到樣品墊上時，由于毛細作用，檢測樣品從樣品墊方向吸水墊方向流動，流經金標結合墊時，樣品與金標結合墊上的納米粒子-抗體復合物發生反應形成樣品-納米粒子-抗體復合物。當樣品-納米粒子-抗體復合物流經硝酸纖維素膜時，又分別與硝酸纖維素膜上的T檢測線與C質控線發生反應，然后根據T線和C線上的顯色程度進行結果判定[8]。

2 應用進展

目前，基于LFIA的設備已被廣泛用于臨床、獸醫、農業食品和環境等領域，能夠檢測蛋白質、核酸、藥物、激素、毒素、病毒和細菌等[4]?；谝酝难芯靠梢钥吹?，LFIA結構方面，許多納米粒子如脂基納米粒子、聚合物納米粒子及無機納米粒子及量子點、磁性、陶瓷和金屬納米粒子(銅、銀、金、鐵)，被廣泛應用于細菌感染檢測上。在這些金納米粒子中，金納米粒子(AuNPs)由于其表面功能化、優異的化學穩定性、生物識別和信號放大特性，提高了與捕獲抗體的偶聯性，并在LFIA試條上充當具有獨特光學特性的顏色標記，能比其他納米粒子更有效地對細菌感染進行檢測[9]?；诮饘偌{米顆粒(MNPs)的標記，特別是金納米顆粒(AuNPs)和銀納米顆粒(AgNPs)具有良好的分析性能、高靈敏度和對多種檢測格式的適應性，在熒光定量分析中得到了廣泛應用。不僅如此，基于金屬納米顆粒(MNPs)的標記可以為LFIA膜的光譜學或光學成像提供定量信息。通常使用包括光源、用于收集最佳光信號的光學透鏡和易于使用的檢測器(如互補金屬氧化物半導體(CMOS)或電荷耦合器件(CCD)相機)，通過測量對應于T線和C線的信號并對背景信號進行信號校正，和預先存儲的校準曲線進行比對來獲得目標分析物濃度?；谥悄苁謾C的LFIA，通過使用智能手機上配備的閃光燈、高性能CMOS攝像頭和數據處理能力，使它能對目標分析物進行定量分析，因此成為LFIA發展的新趨勢[4]。

2.1 臨床應用進展

孫永等利用膠體金側向層析技術對新型冠狀病毒IgG/IgM進行快速檢測，檢測可以在10 min內完成。將檢測結果與臨床血清樣本檢測進行對比，達到80%的準確率。因其便攜、易用且準確，因此可用于疫情早期的大量樣本篩查，作為臨床血清檢測等檢測手段的有效補充[10]。

隨著細菌感染的高患病率及全球抗生素耐藥性的增加，如何早期確定病原菌成為臨床實踐中的一項日益緊迫和困難的任務。世界衛生組織(WHO)報告稱，抗生素耐藥性是一個主要的公共衛生問題，因此需要一種快速而準確的技術來對細菌感染進行檢測。LFIA是一種對細菌進行快速診斷的理想技術。近年來，幾種基于LFIA的試條被用于檢測細菌感染，其目標是從致病菌、全細胞、DNA或生物標記物等范圍內的分析特定的分析物[9]。Martina Zangheri等開發了一種基于智能手機集成的化學發光(CL)-側向流動免疫分析(LFIA)方法的生物傳感器，用于定量檢測唾液皮質，檢出限為0.3 ng/mL，定量分析范圍為0.3～60 ng/mL[11]。

2.2 食品安全領域的應用進展

食品安全是全球衛生工作的重中之重。國外有團隊將基于智能手機的檢測應用于傳統的LFIA技術，發明了一種便攜式生物傳感器，用于葡萄酒和速溶咖啡樣品中赭曲霉毒素A(OTA)的定量檢測，可迅速識別可疑食品批次，及早追查污染源頭，從而大大改善食品安全[12]。國內亦有類似報道，姚幫本等利用膠體金側向層析技術對多種蔬菜中腐霉利進行檢測[13]。另有使用雙重膠體試紙條檢測法對牛乳中四環素和青霉素的檢測[14]及有機磷農藥殘留的檢測等[15]。

2.3 其他領域的應用進展

LFIA還應用于其他領域。據統計，近10年來，應用于農業領域的40%，其中LFIA主要用于檢測植物病害。其次是工業產品或過程質量監測占22%。法醫領域的應用達22%，如血液和非法物質檢測及環境標本檢測[3]。LFIA在文物研究和保護領域也得到了應用，可通過LFIA來檢測文化遺產項目中的蛋白質物質[16]?；蚴褂媚z體金標記多克隆抗體的便攜式免疫層析試條(ICS)對絲綢進行定性檢測等[17]。

3 發展趨勢

LFIA的簡單、易用、便攜等特性使其得到了廣泛應用。但是，LFIA的廣泛應用也存在著一定的潛在風險。非專業或未經培訓的人員使用其可能會出現因操作失誤或對結果的判讀失誤而造成相應的風險或損失。讓LFIA結果更準確易讀、操作更加簡單將是LFLA的發展方向。

目前，大多數LFIA還只能用于定性診斷。未來的發展方向將是對分析物進行靈敏的定量檢測，使用手機對測試結果進行定量判讀將成為未來的重要趨勢[12]。LFIA檢測方法中，基于AuNPs及其衍生物的光學方法最有可能發展并成為最可行的快速診斷實驗技術之一，因為其簡單且容易集成在傳統LFIA條帶中。此外，使用具有較小熱響應的基膜可以進一步提高熱敏LFIA檢測方法的檢測極限。隨著微型機電系統技術、光電光源和傳感器技術的進步和智能手機等移動設備的使用，將促進LFIA向智能化方向發展。智能手機的無線網絡連接能力使遠程診斷成為現實，通過智能手機，檢測結果可以在手機上顯示、存檔，并傳輸給初級保健醫生或醫療中心，進行詳細分析[18]。

4 結語

LFIA技術因其低廉、便攜、可靠、易用等特性得到了廣泛應用，已成為臨床、食品安全、獸醫和環境檢測中重要快速的診斷手段。目前，金納米粒子比色檢測仍是最廣泛使用的檢測方法。提高LFIA技術的靈敏度及對檢測物進行定量分析是近幾十年來研究最多的內容。