兩種SD大鼠酒精依賴自由飲模型的建立

李 齊 安子宜 董澤嵩 劉洪鳳 李 姝 畢鵬翔 霍楠楠 朱曉峰*

（1.牡丹江醫學院生化教研室，黑龍江 牡丹江，157011；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯，154000；3.開灤總醫院檢驗科，河北 唐山，063001；4.麗水市中心醫院檢驗科，浙江 麗水 323000；5.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經科，黑龍江 牡丹江，157011）

酒精依賴綜合征，是現今最為常見的物質依賴疾病之一。到目前為止，酒精依賴的患病人數僅次于尼古丁依賴綜合征，已經成為全球第二大的成癮物質，全球大約有4.9%（約2.4億）的人群受到影響。因為酒精病死的人數約占總病死人數的5.9%。根據2015年全球疾病研究發現，發達國家的致殘致死的5個重要原因之一就是酒精依賴。中國流行病學研究顯示，我國酒精依賴和濫用問題也在日益增多，酒精依賴的研究也隨之增多。現今國內外最常使用的構建酒精依賴大鼠模型的模式主要包括灌胃、自由飲、腹腔注射等方式。本研究通過大鼠自由飲方式，構建了2種不同酒精濃度的酒精依賴大鼠模型，為酒精依賴綜合征的相關研究提供了科學模型方面的實驗根據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究選取6周齡、體質量180～200 g、SPF級雄性SD大鼠30只，購于牡丹江醫學院動物房[SYXK（黑）2019-003]。動物模型構建及其相關檢測在牡丹江醫學院SPF級實驗動物中心鼠類實驗室[SYXK（黑）2019-006]進行。全部大鼠的飼養和使用都按《國立衛生研究院實驗動物護理和使用指南》進行操作，并且符合牡丹江醫學院實驗動物管理條例。

1.1.2 試劑及儀器

無水乙醇（生產企業：深圳邁瑞公司）；高架十字迷宮（生產企業：上海移數信息科技有限公司）；Morris水迷宮視頻分析系統（生產企業：成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 酒精依賴大鼠模型的構建

將30只大鼠單籠飼養，室溫維持在22～24 ℃，光照/黑暗周期為12 h/12 h，環境濕度55%左右。實驗之前使用隨機數表法將大鼠分為3組，每組10只，即對照組（a組），10%自由飲酒精依賴模型組（b組）和20%自由飲酒精依賴模型組（c組）。3組大鼠均每周更換墊料，并對其體質量進行稱量記錄。其中a組雙瓶蒸餾水自由飲喂養。b組在適應性喂養1周后，開始建模喂養，實驗過程中飲食正常，飲水則是每個籠內放置2個飲水瓶。2個水瓶分別是10%酒精溶液和蒸餾水，構建模型期間，每天早上8：00分別測量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并記錄飲酒及飲水的數據。為了避免形成位置偏差，每天必須要交替更換酒瓶和水瓶的位置。所有蒸餾水和10%酒精溶液必須更新1次/d，持續造模4周，共28 d。c組同b組一樣，在適應性喂養1周后，開始建模喂養，實驗過程中飲食正常，飲水則是每個籠內放置2個飲水瓶。第1天8：00雙瓶分別為20%酒精溶液和蒸餾水，第2天8：00分別測量飲酒量（mL/24 h）和飲水量（mL/24 h），并且將裝20%酒精的水瓶替換為蒸餾水瓶，即第2 天大鼠飲用的是雙瓶蒸餾水，如此反復進行交替。為了避免形成位置偏差，每次必須要交替更換水瓶和酒瓶的位置。所有蒸餾水和20%酒精溶液必須更新1次/d，持續造模4周，共28 d。

1.2.2 酒精偏好的測定

構建模型成功后，計算b組和c組的酒精偏好。計算酒精偏好主要是為了掌握大鼠每天消耗的酒精量占了總液體（酒精+蒸餾水）的消耗量百分比，也就是酒精偏好（%）=酒精的消耗總量（mL）/（酒精的消耗總量+水的消耗總量）（mL）×100%。

1.2.3 高架十字迷宮檢測（Elevated plus maze，EPM）

在最后1次飲酒24 h后，把30只大鼠放置在室溫恒定（24 ℃）、室內光線昏暗恒定的測試實驗室中，全程保持安靜，對3組大鼠完成高架十字迷宮的測試。十字高架位于地面上方的65 cm處，由2條開放臂、2條閉合臂以及中央區共同組成。點擊EPM測試系統，設置本次測試實驗的參數（包括開放臂和閉合壁進入次數、開放臂和閉合壁滯留時間、動物運動總距離等），完畢后，把大鼠放置在設備“十”字正中央位置，每只大鼠的測試時間為3 min。每次檢測完畢后，一定要使用乙醇棉球對整個設備擦拭，然后再繼續進行下一只大鼠測試。實驗參數：開放臂進入次數（OE，次）：即大鼠進入到EPM任意一條開放臂的次數，每次活動的開始是以該鼠的4個爪都進入到開放臂內或者大鼠軀體約有80%進入臂內開始，在實驗中途有1個爪從該開放臂中完全撤出即認為本次的進入活動結束；開放臂滯留時間（OT，s）：即大鼠進入到開放臂中所停留的時間；總路程（cm）：即大鼠在十字高架中行動的總距離。數據分析使用EPM自帶的動物行為學軟件完成。大鼠進入任意一條開放臂的次數越少，在開放臂里滯留的時間越短，則說明大鼠焦慮情況越加的嚴重。

1.2.4 水迷宮測試（Morris water Maze，MWM）

Morris水迷宮圓形的水池池壁，黑色的池底，在水池的四周掛避光的窗簾，對實驗區域光線進行遮擋。水池根據實驗等分成為四個區域（即四個象限）。第一象限的中間放置一個水面以下0.5 cm 的平臺，平臺可以被拆除。每次實驗都需要將大鼠移開，并用吹風機將其吹干，放回籠內。Morris水迷宮可以用來檢測酒精自由飲模型的學習與記憶能力（包括空間探索實驗和定位航行實驗）。定位航行實驗需要連續進行4 d，固定時間段訓練，2次/d，每次訓練時間間隔15 min，游泳訓練時間為60 s/次，每次訓練要從池壁4個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。如果大鼠在60 s內能夠找到平臺，就讓它呆在平臺上30 s，加強大鼠的學習記憶；如果60 s內未找到平臺，就把它用工具引導到平臺上并且使其停留30 s。以大鼠每天每次到達路徑長度（游泳距離）和平臺的時間（潛伏期）進行測量，如果游泳距離和潛伏期越短，則說明其學習能力越強。空間探索實驗是需要在定位航行實驗結束之后24 h進行，對動物空間位置記憶的保持能力進行測量，只需要進行1次。定位航行實驗和本次實驗的差異在于要將水面高度調節到預定的高度之后需要移除平臺，大鼠在目標象限的對側放出，游泳時間延長為120 s。在空間探索實驗中，記錄大鼠在目標象限的停留時間和穿越目標象限的次數。穿越平臺次數越多，在平臺所在象限游泳停留時間越長，就說明大鼠學習能力越強。

1.2.4 酒精戒斷綜合征評分（scores of ethanol withdrawal syndrome，EWS）

根據Motaghine-jad M等的方法，在最后1次飲酒24 h后對3組大鼠進行改良酒精戒斷行為學的觀測評分，30只大鼠都需要在同一環境下進行評分觀測。觀測項目包括了5個項目和總評分，即刻板行為、激惹性、尾巴強直、異常姿勢和聽源性癲癇發作情況以及總評分，其中5個項目相加為總評分，每個項目的評分增高說明戒斷的癥狀在加重。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 10%酒精依賴模型組和20%酒精依賴模型組的體質量、飲酒量和飲酒偏好

2.1.1 3組大鼠體質量比較

實驗前，3組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（F=1.206，P=0.315）。實驗結束時，飲酒組（b組和c組）與對照組（a組）大鼠體質量比較，差異無統計學意義（F=0.905，P=0.416）。見圖 1。

圖1 3組大鼠體質量變化情況

2.1.2 建模期內3組大鼠飲酒量、飲水量和酒精偏好

在雙瓶（酒精+蒸餾水）自由飲喂養模式下，b組在經歷了連續28次雙瓶自由飲，在最后7 d的酒精攝入量（16.80±0.63）mL/24 h保持穩定，飲水量（11.90±0.39）mL/24 h穩定，酒精偏好穩定在（57.74±1.83）%，差異無統計學差異（F=1.762，P=0.121）。見圖2（A和B）。c組在經歷了14次循環（28 d）間歇性雙瓶飲時，酒精的攝入量逐步增多，直至達到平臺期（16.65±1.31）mL/24 h，而飲水量伴隨著飲酒量的增多而減低，直至穩定在了（10.30±0.98）mL/24 h，酒精偏好增加至（61.77±2.81）%。見圖3（C和D）。

圖2A b組大鼠最后7 d飲酒量、飲水量

圖2B b組大鼠最后7 d酒精偏好變化

圖3C c組大鼠飲酒量、飲水量

圖3D c組大鼠酒精偏好變化

2.2 高架十字迷宮測試（EPM）比較各組行為學變化

在b、c組最后1 d飲酒后24 h，對3組大鼠進行EPM檢測。與a組比較，2組模型組在EPM測試中，其開放臂探索次數和時間均明顯減少，b組開放臂探索次數更少，差異有統計學意義（t=7.946，P＜0.05），開放臂探索時間更短，差異有統計學意義（t=13.021，P＜0.05）；c組開放臂探索次數更少，差異有統計學意義（t=7.589，P＜0.01），開放臂探索時間更短，差異有統計學意義（t=16.045，P＜0.05）。3組大鼠總運動距離分別為（999.12±3.24）cm、（1 001.01±3.95） cm 和（999.98±3.67）cm，差異無統計學意義（F=0.680，P=0.515）。以上結果說明，酒精依賴大鼠在酒精戒斷后能夠出現焦慮行為，但酒精對大鼠的運動能力無明顯的影響。高架十字迷宮的測試結果。見表1。

表1 3組大鼠高架十字迷宮實驗結果比較 （）

2.3 3 組大鼠水迷宮實驗結果

2.3.1 3 組大鼠游泳總距離和潛伏期比較

在定位航行實驗進行中，與a組相比，b組、c組大鼠記憶和學習能力明顯下降，其游泳總距離明顯變短，潛伏期也明顯縮短，其中實驗第2天，b組、c組與a組相比，差異有統計學意義（t=-4.344，P＜0.05；t=-2.320，P＜0.05）；實驗第3天，b組、c組與a組相比，差異有統計學意義（t=-4.321，P＜0.05；t=-2.964，P＜0.05）；實驗第 4天，b組、c組與a組相比，差異有統計學意義（t=-5.090，P＜0.05；t=-4.117，P＜0.05）。見表 2、表 3。

表2 3組大鼠在4 d實驗日潛伏期比較 （，s）

表3 3組大鼠在4 d實驗日游泳總距離比較 （，cm）

2.3.2 3組大鼠穿越平臺次數和目標象限停留時間比較

實驗第5天，MWM進行空間探索實驗，與a組比較，b組、c組在目標象限（即第一象限）滯留時間變少，差異有統計學意義（t=5.254，P＜0.05；t=4.011，P＜0.05）；與 a組比較，b組、c組平臺穿越次數明顯下降，差異有統計學意義（t=3.517，P＜0.05；t=3.591，P＜0.05）。見表4。

表4 3組大鼠目標象限滯留時間和穿越平臺次數比較 （）

2.4 酒精戒斷評分對大鼠的戒酒癥狀的評價

b組、c組在飲酒期間很溫順，不容易被激惹，并很少會出現攻擊性行動。與a組（2.50±0.71）分比較，b組（11.05±0.97）分、c組（12.10±0.99）分在戒酒24 h的戒斷總評分明顯升高，差異有統計學意義（t=-23.681，P＜0.05；t=-24.878，P＜0.05）。見圖 4。

圖4 3組大鼠的酒精戒斷綜合征評分比較

3 討論

構建成功的實驗動物模型是進行科學研究的第一個非常關鍵的步驟。國內外在構建酒精依賴模型的時候多會選用灌胃、腹腔注射以及自由飲的方法，各有優缺點。根據文獻分析，酒精依賴的大鼠模型假如用自由飲模式進行模型的構建，則會避免對大鼠腹腔連續注射酒精而引起的感染，以及灌胃大鼠致使的上消化道不適，從而降低了造模大鼠的死亡率。同時，自由飲構建酒精依賴模型更符合人的飲酒方式，更適合做后續酒精依賴實驗研究。但是自由飲模型也有缺陷，即動物對酒精的喜好影響了模型的構建。因此，本研究選擇雄性大鼠進行實驗，在構建模型后，對模型進行行為學測試，篩選出已經成功的模型。目前自由飲構建模型的方法很多，本研究選用大鼠來制備10%雙瓶自由連續性飲酒模型組和20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組。結果表明，以上2種不同的制備模型方法都能達到實驗要求，10%雙瓶自由連續性飲酒模型組在最后7 d的酒精攝入量保持穩定，酒精偏好穩定，該實驗的結果和Sona Khan M等構建動物自由飲模型的結果接近；20%雙瓶自由間歇性飲酒模型組在通過28 d間歇性酒精造模，其酒精攝入量在逐步增多，最后到達平臺期，該實驗的結果和Hwa L S等構建動物自由飲模型的結果相類似。EPM中2組模型組與對照組相比較發現，在開放臂中探索時間與次數均明顯降低。在水迷宮實驗中，大鼠記憶和學習能力明顯降低，即說明長時間的飲酒，會導致記憶和學習能力明顯下降。通過自愿飲酒量的增加，以及酒精偏好的增加，提示了本實驗已經成功建立大鼠的酒精依賴模型，大鼠的行為學測試也說明自由飲的造模效果很好。

綜上所述，10%持續自由飲和20%間斷自由飲的建模方法均可以進行酒精依賴的后續相關的動物實驗研究。