甘精胰島素原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究*

張紅梅，方 芳，李祥勝，許雷鳴△

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051）

甘精胰島素是采用基因重組技術(shù)獲得的一種新型人胰島素類似物，屬于長效胰島素［1］。與人胰島素相比，甘精胰島素結(jié)構(gòu)A鏈的21位置由甘氨酸代替了天門冬酰胺，B鏈的C末端增加了2個精氨酸殘基，其等電點(diǎn)也升至6.7，這使得其注射后在人體皮下的pH環(huán)境下會形成沉淀，延長了藥物吸收和作用的時間。作用時間較長，代謝時間也較長，對血糖的影響較小，導(dǎo)致的低血糖概率較低，適用于各階段的1型糖尿病患者和部分2型糖尿病患者［2-3］。甘精胰島素原料藥為白色或類白色粉末，難溶于水，故需溶解后再行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，否則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。依據(jù)2020年版《中國藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（選其中凝膠法）［4］178-181、通則9301注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則［4］517-518、通則9251細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則［4］515-516及相關(guān)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查文獻(xiàn)［5-7］，采用0.01 mol/L鹽酸溶液作為溶劑，研究甘精胰島素對細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾情況，建立甘精胰島素原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ET-96型內(nèi)毒素凝膠法測定儀（天大天發(fā)科技有限公司）；XS105DU型電子天平（德國Mettler Toledo公司）；HS-1300型凈化工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；MS3 Digital型旋渦混勻器（德國IKA公司）。

1.2 試藥

甘精胰島素原料藥（合肥天麥生物科技發(fā)展有限公司，批號分別為B201901001，B201901002，B201901003）；鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號為2 103101；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號為21 080912；靈敏度均為0.25 EU/mL，規(guī)格均為0.1 mL/支）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品，中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-202089，效價為每支90 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水，湛江安度斯生物有限公司，批號為2002260，規(guī)格為每瓶50 mL）；鹽酸（上海沃凱生物技術(shù)有限公司，批號為20171107，規(guī)格為每瓶500 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值確定

參照《美國藥典（第43版）》《歐洲藥典（第10版）》和《日本藥局方（第17版）》，確定甘精胰島素原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值（L）為10 EU/mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品適量，加BET用水溶解，旋渦15 min，按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143項(xiàng)下方法進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，結(jié)果見表1（+為凝膠形成且倒轉(zhuǎn)不會變形或滑脫；-為凝膠未形成或凝膠形成但倒轉(zhuǎn)會變形。下表同）。結(jié)果兩個不同廠家的鱟試劑靈敏度均為0.5λ～2.0λ，符合規(guī)定。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab.1 Results of the verification of TAL sensitivity

2.3 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

目前市售鱟試劑λ多為0.5～0.03 EU/mL，依據(jù)公式C=λ/L，則甘精胰島素對應(yīng)的最小有效稀釋濃度分別為0.05，0.025，0.012 5，0.006，0.003 mg/mL。取樣品（批號為B201901001）16.10 mg，精密稱定，先加2.0 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液溶解，再加BET用水分別制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 mg/mL的系列NPC溶液，稀釋過程中無樣品析出。同法制備上述系列溶液，分別加入2.2項(xiàng)下細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使溶液均含2λ（即0.5 EU/mL，下同）的內(nèi)毒素，得系列PPC溶液。取系列NPC和PPC溶液各適量，分別與2批鱟試劑混勻后封口，在內(nèi)毒素凝膠法測定儀中37℃保溫60 min。每個濃度平行2管，同時設(shè)陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品在0.4 mg/mL及以下質(zhì)量濃度可能不干擾鱟試劑和細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)。

表2 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the preliminary interference test

2.4 預(yù)先添加標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品20 EU加入16.13 mg樣品中，加2.0 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液使溶解，加BET用水稀釋至含內(nèi)毒素2λ的樣品稀釋液，按2.3項(xiàng)下方法制備0.4 mg/mL的樣品稀釋液，同法制成含內(nèi)毒素λ、0.5 λ、0.25 λ的溶液，按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143項(xiàng)下細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的凝膠法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表3（Et為2λ/供試品溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值；Es為2λ/BET用水反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值。結(jié)果表明，0.01 mol/L鹽酸溶液溶解樣品未使預(yù)先添加的細(xì)菌內(nèi)毒素失去活性。

表3 預(yù)先添加標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the interference test for added standard endotoxin in advance

2.5 正式試驗(yàn)

分別取批號為B201901001，B201901002，B201901003的樣品16.04，16.17，16.16 mg，精密稱定，分別加2.0 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液使溶解，再用BET用水稀釋制成0.4 mg/mL的供試品溶液，按凝膠法進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，采用靈敏度為0.25 EU/mL的2個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑，Es及Et均為0.5 λ～2.0 λ。表明樣品稀釋制成0.4 mg/mL后對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。

表4 正式干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of the formal interference test

2.6 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立

取樣品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液溶解制成每1 mL中含8 mg的溶液，按2020年版《中國藥典（四部）》通則1143項(xiàng)檢查，每1 mg樣品中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于10 EU。

2.7 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)2.5項(xiàng)下干擾試驗(yàn)結(jié)果，分別取上述0.4 mg/mL供試品溶液，用2批鱟試劑按上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和凝膠法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，3批樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素限量均符合本研究擬訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表5 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.5 Results of the BET

3 討論

目前《中國藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查為鱟試劑法，相較于家兔熱原檢查法，該方法具有檢測速度快、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)［8-16］。2020年版《中國藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法收錄了凝膠法和光度測定法，均可用于樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，但當(dāng)檢測結(jié)果有爭議時，多以前者試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)［4］。故本研究中采用凝膠法建立甘精胰島素原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

甘精胰島素原料藥難溶于水，在酸性條件下溶解度較好。若直接加水制成混懸液對樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。故考慮先用稀鹽酸溶液溶解樣品，再以BET用水稀釋進(jìn)行試驗(yàn)。為確保所選擇的處理方法能有效排除干擾且不會使內(nèi)毒素失活，須使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)［4］。為確認(rèn)溶劑不會使樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素失活，進(jìn)行了預(yù)先添加標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)，結(jié)果表明采用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解樣品，對樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果無影響。

干擾預(yù)試驗(yàn)可用來評估甘精胰島素對鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度，初步篩查出不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的供試品溶液濃度范圍。正式干擾試驗(yàn)是進(jìn)一步確認(rèn)干擾預(yù)試驗(yàn)初篩出的無干擾供試品溶液質(zhì)量濃度。由于不同廠家鱟試劑的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量參數(shù)存在差異，抗干擾能力可能有所不同，故本試驗(yàn)中采用2個廠家鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)。本研究中，甘精胰島素細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的最大不干擾質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，故可以選擇市售任意靈敏度鱟試劑對甘精胰島素進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

綜上所述，本研究建立的方法可用于甘精胰島素原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并可為采用稀鹽酸作為溶劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立提供參考。