替格瑞洛對(duì)急性心肌梗死小鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

宋占春，陳 亮，何廉旗，張 迪，任智超，張 建

(遼寧省撫順市中心醫(yī)院：1.心內(nèi)科；2.普通外科 113006)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種突發(fā)嚴(yán)重的缺血性心臟病，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)生命健康。心肌梗死部位炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)與活化在AMI過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其以巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為主[1]。替格瑞洛(ticagrelor)是一種新型血小板抑制劑，通過(guò)和P2Y12受體結(jié)合，抑制血小板活性，防止冠心病患者發(fā)生血栓事件，但目前對(duì)替格瑞洛的其他藥理功能仍知之甚少[2-3]。據(jù)報(bào)道，替格瑞洛可抑制巨噬細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎癥小體的激活，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展[4]。在AMI中，通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和NLRP3炎癥小體激活可明顯改善心肌功能，發(fā)揮對(duì)AMI的治療作用[5-6]。研究表明，P2Y12受體被抑制可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞自噬，進(jìn)而改善動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[7]。而在AMI中，促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬可緩解疾病進(jìn)程[8]。推測(cè)替格瑞洛可能通過(guò)影響NLRP3炎癥小體激活和細(xì)胞自噬作用調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在AMI中發(fā)揮保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)替格瑞洛在小鼠AMI模型中的作用開(kāi)展研究，以期為臨床開(kāi)發(fā)治療AMI的有效藥物提供新的方向和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8周齡雄性C57BL/6小鼠30只(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司)，體重22～22 g；替格瑞洛(T125095)；小鼠肌鈣蛋白(cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ)ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒[聯(lián)科集團(tuán)(中國(guó))有限公司]；CD68抗體、P62抗體、pro-IL-1β(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)；NLRP3抗體、半胱天冬酶-1(caspase-1)抗體、cleaved IL-1β抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、Beclin-1抗體、p62抗體、β-actin抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠AMI模型建立及藥物干預(yù)

將8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(sham組)、AMI組、替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組、替格瑞洛預(yù)處理+治療組。除sham組外，其余各組小鼠均采用左前降支冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的方法建立AMI模型。小鼠術(shù)前禁食禁水12 h后，麻醉，剃胸毛，消毒。切開(kāi)皮膚，用鈍器剝離肌肉，切開(kāi)心包，露出心臟。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，觀察到結(jié)扎端蒼白，表明結(jié)扎成功。替格瑞洛治療組建模成功后每天同一時(shí)間給予替格瑞洛(27 mg/kg)，灌胃7 d；替格瑞洛預(yù)處理組于建模前7 d每天同一時(shí)間給予替格瑞洛(27 mg/kg)，灌胃7 d；替格瑞洛預(yù)處理+治療組于建模前7 d至建模后7 d持續(xù)每天同一時(shí)間給予替格瑞洛(27 mg/kg)灌胃。sham組和AMI組為對(duì)照組，給予與實(shí)驗(yàn)組等量生理鹽水灌胃。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后取小鼠血清、心肌組織，并統(tǒng)計(jì)心臟質(zhì)量和小鼠體重。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

采用美國(guó)GE Voluson E8四維彩超儀對(duì)各組小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，計(jì)算心臟功能相關(guān)指標(biāo)，包括左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.2.3ELISA檢測(cè)cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性

將各組小鼠全血室溫放置2 h后，1 000×g離心20 min，獲得血清標(biāo)本。參考ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色

對(duì)心肌組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后封片。于顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.2.5心肌組織炎癥指標(biāo)檢測(cè)

取小鼠心肌組織，冰浴勻漿后，1 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-18表達(dá)水平。

1.2.6免疫熒光染色

將心肌組織脫水包埋切片。使用山羊血清室溫封閉15 min，加入一抗(1∶100稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。次日，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，滴加熒光二抗(1∶200稀釋)室溫孵育60 min，PBS清洗后，晾干，蓋玻片封片。于熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平

取小鼠心肌組織，冰上研磨后，于細(xì)胞裂解液靜置30 min，12 000 r/min，4 ℃，離心20 min，上清液為蛋白質(zhì)抽提物。采用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，40 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，放入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG(IgG-HRP)二抗室溫孵育45 min后，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)底物發(fā)光，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶光密度值。

1.2.8透射電鏡觀察

將心肌組織于電鏡固定液固定后，依次進(jìn)行室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片。于2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min，70%乙醇及超純水各清洗3次，2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗后，室溫干燥過(guò)夜。于透射電子顯微鏡下觀察染色效果，鏡下采集圖像分析。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心臟功能的影響

與sham組相比，造模成功后AMI組小鼠心臟LVIDd、LVIDs均明顯增加(P<0.01)，F(xiàn)S、EF均明顯降低(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組上述指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度恢復(fù)(P<0.05或P<0.01)，其中，替格瑞洛預(yù)處理+治療組恢復(fù)效果優(yōu)于替格瑞洛治療組和替格瑞洛預(yù)處理組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 小鼠超聲心電圖各參數(shù)結(jié)果比較

與sham組相比，AMI組小鼠血清cTnⅠ水平、CK-MB和LDH活性及心臟質(zhì)量/體重比值均明顯增加(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組上述指標(biāo)均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，替格瑞洛治療組除心臟質(zhì)量/體重比值，其余各項(xiàng)指標(biāo)均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 小鼠血清cTn I水平、CK-MB和LDH活性及心臟質(zhì)量/體重比值比較

2.2 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心肌組織病理變化的影響

HE染色可見(jiàn)AMI組小鼠心肌組織肌纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組小鼠心肌組織炎癥細(xì)胞減少，結(jié)構(gòu)排列更整齊，其中替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，見(jiàn)圖1A～E。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織梗死面積明顯增大；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組小鼠心肌組織梗死面積均出現(xiàn)不同程度的減小，其中，替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組小鼠梗死面積減少更明顯，見(jiàn)圖1F。

A：sham組小鼠心肌組織HE染色(200×)；B：AMI組小鼠心肌組織HE染色(200×)；C：替格瑞洛治療組小鼠心肌組織HE染色(200×)；D：替格瑞洛預(yù)處理組小鼠心肌組織HE染色(200×)；E組：替格瑞洛預(yù)處理+治療組小鼠心肌組織染色(200×)；F：小鼠心肌組織TTC染色。

2.3 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心肌組織炎癥因子的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織炎癥因子IL-18、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與AMI組比較，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組上述指標(biāo)表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，其中，替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預(yù)處理組次之，見(jiàn)圖2。

A：IL-18水平；B：IL-1β水平；C：TNF-α水平；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.05，c：P<0.01，與AMI組相比；d：P<0.05，e：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；f:P<0.01，與替格瑞洛預(yù)處理組相比。

2.4 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心肌組織巨噬細(xì)胞的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其中替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織CD68表達(dá)情況(IF，400×)

2.5 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心肌組織NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組小鼠心肌組織NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組上述蛋白表達(dá)水平均呈不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，其中替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預(yù)處理組次之，見(jiàn)圖4。

A：蛋白條帶圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.05，c：P<0.01，與AMI組相比；d：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；e：P<0.01，與替格瑞洛預(yù)處理組相比。

2.6 替格瑞洛對(duì)AMI小鼠模型心臟組織自噬的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組p62陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組p62陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其中替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠心肌組織p62表達(dá)情況(IF，400×)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham組相比，AMI組p62表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，而LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表達(dá)水平有所增加，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與AMI組相比，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表達(dá)水平均明顯增加(P<0.01)，而p62表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，其中替格瑞洛預(yù)處理+治療組變化最明顯，替格瑞洛預(yù)處理組次之，見(jiàn)圖6。

A：蛋白條帶圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.01，與sham組相比；b：P<0.01，與AMI組相比；c：P<0.05，d：P<0.01，與替格瑞洛治療組相比；e：P<0.05，f：P<0.01，與替格瑞洛預(yù)處理組相比。

電鏡結(jié)果顯示，與AMI組比較，替格瑞洛治療組、替格瑞洛預(yù)處理組和替格瑞洛預(yù)處理+治療組小鼠心肌細(xì)胞自噬小體數(shù)量均呈不同程度的增加，見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠心肌細(xì)胞自噬小體數(shù)量的變化情況(電鏡，40 000×)

3 討 論

AMI是冠心病常見(jiàn)的急重病，嚴(yán)重危害患者生命健康[9]。P2Y12受體拮抗劑替格瑞洛是AMI中抗血栓治療的一線用藥[10]。CHEN等[11]發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體途徑而不依賴(lài)P2Y12受體在糖尿病心肌病小鼠中發(fā)揮抗炎作用。NLRP3炎癥小體途徑是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)該途徑被激活時(shí)，NLRP3與其他蛋白相互作用精細(xì)調(diào)節(jié)caspase-1激活，而活化的caspase-1(cleaved caspase-1)通過(guò)剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生具有致炎活性的IL-1β和IL-18，進(jìn)而激活其他免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)更多的趨化因子和炎癥因子的合成，放大炎癥反應(yīng)[12]。自噬是體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，用于回收和去除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以及破壞細(xì)胞內(nèi)病原體[13]。研究表明，自噬可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)NLRP3小體途徑的激活，是炎癥小體的主要調(diào)節(jié)因子[14-16]。因此，自噬功能障礙可導(dǎo)致炎癥小體過(guò)度激活，包括NLRP3。研究證實(shí)，心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬在AMI發(fā)病機(jī)制中占重要地位[17-20]。

為了探究替格瑞洛在AMI中潛在的作用，本研究采用結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈的方法建立AMI小鼠模型，分別在造模前后不同時(shí)間給予替格瑞洛治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛可保護(hù)心肌免受損傷，使LVIDd、LVIDs明顯降低，F(xiàn)S、EF明顯增加，血清cTnⅠ水平降低，CK-MB和LDH活性降低，心臟的臟器系數(shù)(心臟質(zhì)量/體重)降低，心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，心臟梗死面積明顯減小。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)替格瑞洛可明顯降低心肌組織中促炎細(xì)胞因子IL-18、IL-1β和TNF-α表達(dá)，抑制CD68蛋白(巨噬細(xì)胞蛋白標(biāo)志物)表達(dá)，表明替格瑞洛可能通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子釋放和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在AMI中發(fā)揮抗炎作用。進(jìn)一步對(duì)NLRP3途徑相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛可明顯降低NLRP3、cleaved caspase-1、pro-IL-1β和cleaved IL-1β表達(dá)，表明替格瑞洛可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體途徑的激活進(jìn)而抑制心肌組織炎癥反應(yīng)。同時(shí)，為探究替格瑞洛是否干預(yù)AMI模型中心肌細(xì)胞自噬水平，本研究通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AMI模型小鼠心肌組織中有大量的p62分布，而應(yīng)用替格瑞洛干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，替格瑞洛抑制p62在心肌組織的分布，同時(shí)Western blot定量結(jié)果也顯示了替格瑞洛可促進(jìn)LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1表達(dá)，抑制p62表達(dá)。最后，通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)替格瑞洛干預(yù)后自噬小體明顯增多，結(jié)果均表明替格瑞洛可通過(guò)促進(jìn)AMI模型心肌細(xì)胞自噬而發(fā)揮保護(hù)作用。此外，在上述全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，替格瑞洛預(yù)處理+治療組干預(yù)AMI效果最好，替格瑞洛預(yù)處理組次之，表明替格瑞洛對(duì)AMI的防治意義重大。

綜上所述，本研究初步驗(yàn)證了替格瑞洛具有抗炎、促進(jìn)自噬、改善梗死心臟功能和形態(tài)的作用，為AMI疾病的預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)和治療見(jiàn)解。本研究的不足之處在于：(1)未進(jìn)行細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)探究替格瑞洛作用于心肌細(xì)胞的具體分子機(jī)制；(2)未設(shè)立NLRP3激動(dòng)劑組及自噬抑制劑組進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究替格瑞洛的防治效果；(3)未闡明NLRP3炎癥小體途徑和細(xì)胞自噬之間的crosstalk機(jī)制。今后可在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)，以探索和闡明替格瑞洛對(duì)AMI的保護(hù)作用機(jī)制。