高糖培養對大鼠腎小管上皮細胞中SIRT1和PGC-1α水平及線粒體功能的影響*

劉興梅， 金紅君， 沈燕， 何曉蘭， 田禾

(1.貴州省人民醫院 檢驗科, 貴州 貴陽 550002； 2.貴州省人民醫院 腎內科， 貴州 貴陽 550002； 3.貴州省人民醫院 病理科, 貴州 貴陽 550002； 4.貴州省臨床檢驗中心 檢驗檢測科, 貴州 貴陽 550002)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease, DKD)伴有腎小球硬化、系膜細胞擴張以及腎間質纖維化等一系列病理變化，如不及時治療，隨著病程進展將發展為終末期腎病。研究發現，氧化應激與DKD密切相關，但其發病機制尚未明了[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α，PGC-1α)是一種轉錄共激活因子，亦是線粒體生物發生和功能的主要調節因子。PGC-1α在高能量需求的組織中高表達，與糖脂代謝相關[2]。足細胞構成腎小球濾過屏障的外層，其能量需求依賴于與線粒體動力學密切相關的有效氧化呼吸。高糖可降低PGC-1α的表達，并降低足細胞中的線粒體DNA含量，從而改變線粒體生物發生和導致線粒體DNA損傷[3]。沉默配對型信息調節因子2同源物1(sirtuin 1，SIRT1)是一種多能分子，在細胞存活和凋亡、炎癥應激以及細胞生長、分化、代謝等方面發揮著重要作用，通過改變底物的乙酰化狀態來調節其轉錄活性和蛋白質表達水平，參與ATP的生成，從而改善線粒體功能障礙[4]。目前對腎小管上皮細胞，PGC-1α與SIRT1是否能通過保護線粒體從而減少高糖所致的細胞凋亡和細胞能量改變的研究甚少，因此，本研究通過體外培養NRK52E細胞，探討在高糖環境下SIRT1和PGC-1α對NRK52E細胞中線粒體損傷及凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

NRK52E細胞購買于美國模式培養物集存庫(American type culture collection, ATCC)，抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、PGC-1α、SIRT1、cleaved-Caspase-3(proteintech)、 腺嘌呤核苷三磷(adenosine-triphosphate, ATP)含量檢測試劑盒(Solarbio)、線粒體膜電位檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒及超敏增強化學發光劑(enhanced chemiluminescence, ECL)化學發光試劑盒為碧云天產品。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 NRK52E細胞株復蘇：液氮罐中取出細胞，迅速放入37 ℃水浴箱融化，將細胞懸液加入含DMEM培養基的離心管，反復吹打，800 r/min離心5 min，小心吸棄上清，加含10% FBS 低糖DMEM培養基4 mL，重懸細胞，接種于25 cm2培養瓶，于37 ℃ 5% CO2培養箱培養。

1.2.2細胞分組及處理 將NRK52E細胞分為正常糖組(NG組，含糖5.5 mmol/L、10% FBS的DMEM培養)和高糖組(HG組，含糖30 mmol/L、10% FBS的DMEM培養)，培養48 h后收集細胞。

1.2.3流式細胞儀檢測線粒體ROS水平 按照1 ∶1 000用無血清培養液稀釋活性氧熒光探針(DCFH-DA)，使終濃度為10 μmol/L；細胞收集后懸浮于稀釋好的 DCFH-DA中，細胞濃度為1.0×108～2.0×1010個/L，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.2.4流式細胞儀檢測線 粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm) 收集細胞用PBS洗滌細胞3次，收集不多于1×106個細胞，取10×Incubation Buffer 100 μL加滅菌去離子水900 μL稀釋成1×Incubation Buffer，混勻并預熱至37 ℃，吸取1×Incubation Buffer 500 μL，加入JC-1 1 μL旋渦混勻配成JC-1工作液；取JC-1工作液500 μL將細胞均勻懸浮，37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育15～20 min，室溫離心(2 000 r/min, 5 min)收集細胞，用1×Incubation Buffer 洗2次；吸取10×Incubation Buffer 500 μL重新懸浮細胞，流式細胞儀檢測分析。

1.2.5紫外分光光度法檢測線粒體ATP 先收集細胞到離心管內、棄上清，比例為細胞數量(104個) ∶提取液體積(mL)=(500～1 000) ∶1(建議500萬細胞加入提取液1 mL)， 超聲波破碎1 min(冰浴，強度 20%或200 W，超聲2 s，停1 s)，12 000 r/min 4 ℃離心10 min；取上清液至另一EP管中，加入氯仿500 μL震蕩混勻，12 000 r/min 4 ℃離心3 min，取上清，置冰上待測。

1.2.6Western blot檢測PGC-1α、SIRT1和cleaved-Caspase-3蛋白水平 從各組細胞中提取蛋白質并轉移到膜上，4 ℃下與PGC-1α(proteintech, 1 ∶1 000)、抗SIRT1(proteintech, 1 ∶1 000)、抗cleaved-Caspase-3(proteintech, 1 ∶1 000)以及鼠抗GAPDH蛋白(proteintech, 1 ∶3 000)單克隆抗體孵育過夜；用含有0.1%Tween-20(TBST)的Tris緩沖液重復洗滌膜，用Tris緩沖液(TBS)洗滌1次，二抗孵育1 h；加入超敏ECL化學發光試劑盒顯現免疫染色的蛋白質。通過ImageJ軟件分析條帶強度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ROS水平

NRK52E細胞培養48 h后，與NG組比較，HG組ROS的表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

注：A為活性氧的表達水平，B為活性氧表達水平統計；(1)與NG組比較，P<0.01。圖1 NG、HG組NRK52E細胞的ROS水平Fig.1 ROS levels of NRK52E cells in NG and HG groups

2.2 ΔΨm表達

NRK52E細胞培養48 h后，與NG組比較，HG組線粒體ΔΨm的表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：A為線粒體膜電位，B為線粒體膜電位統計條圖；(1) 與NG組比較，P<0.05。圖2 NG、HG組NRK52E細胞中ΔΨm Fig.2 ΔΨm levels of NRK52E cells in NG and HG groups

2.3 線粒體ATP水平

NRK52E細胞培養48 h后，與NG組比較，HG組線粒體ATP水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

2.4 PGC-1α、SIRT1與cleaved-Caspase-3蛋白的表達

NRK52E細胞培養48 h后，與NG組比較，HG組NRK52E細胞中PGC-1α蛋白表達明顯降低(P<0.01)、SIRT1蛋白表達降低(P<0.05)，cleaved-Caspase-3蛋白表達明顯增加(P<0.01)。見圖4。

注：(1) 與NG組比較，P<0.01。圖3 NG和HG刺激后NRK52E細胞中ATP水平Fig.3 ATP levels of NRK52E cells in NG and HG groups

注：與NG組比較，(1) P<0.01, (2) P<0.05。圖4 NG、HG組NRK52E細胞中PGC-1α、SIRT1與cleaved-Caspase-3蛋白的表達(Western blot)Fig.4 The protein expression levels of PGC-1α，SIRT1， and cleaved-Caspase-3 in NRK52E cells in NG and HG groups (Western blot)

3 討論

大量的研究表明，氧化應激在DKD的發生發展中起著獨立作用[5-6]。線粒體是ROS產生的主要來源。在DKD進程中，代謝底物的傳遞對于ATP的產生會改變脂肪酸和氧的含量，糖尿病患者為滿足ATP需求而使用的燃料源會導致耗氧量增加，線粒體能量障礙，釋放過多的ROS，導致氧化應激，進而從線粒體膜釋放細胞色素酶C，激活caspase-9和caspase-3通路，從而引起細胞凋亡和線粒體損傷[6-7]。腎臟組織富含線粒體，具有高能量需求，因此線粒體功能失調可能導致腎固有細胞損傷，導致腎功能和結構損傷。ROS的產生水平超過了局部抗氧化能力，是糖尿病腎臟線粒體功能障礙的生物標志[8]。然而，高糖如何引起線粒體損傷及細胞凋亡的機制不完全清楚。

PGC-1α對于維持能量穩態至關重要。PGC-1α調節線粒體生物發生、肝臟糖異生，參與呼吸鏈亞單位，包括β-ATP合酶、細胞色素C氧化酶(COX)IV和細胞色素C的調控[9]。早期研究發現，PGC-1α過度表達可減少胰島B細胞胰島素分泌，而且PGC-1α在B細胞凋亡、再生、胰島素分泌以及線粒體新陳代謝中發揮作用[10]。線粒體是一種復雜的細胞器，可以調節多種生理功能的細胞過程和功能，包括氧化還原調節與細胞凋亡等。在DKD的發展過程中，氧化應激是一個主要的病理過程，而川芎嗪硝酮可通過調控PGC-1α的表達進而改善HK-2中線粒體功能，恢復腎臟功能[11]。一方面高糖環境刺激足細胞使線粒體的電子傳遞鏈激活，產生氧化應激，大量ROS產生，線粒體功能障礙，另一方面線粒體在胰島素分泌中起著重要作用。線粒體DNA(mtDNA)突變與糖尿病發病的病因有關[12]。本研究結果也表明，高糖環境下，NRK52E細胞中PGC-1α的表達減少，線粒體膜電位降低，ROS產生增加，凋亡相關蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表達增加，這些結果提示，高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡、氧化應激，而PGC-1α具有保護線粒體的作用，高糖可能通過抑制PGC-1α的表達引起線粒體功能障礙。

Sirtuins參與抗氧化和氧化應激相關的過程和功能，如線粒體功能、DNA損傷修復、代謝，并影響細胞能量和氧化還原平衡。此外，由于sirtuins的脫乙?；钚砸蕾囉贜AD+，即一種氧化還原信號分子，Sirtuins通過調控控制細胞內NAD+/NADH比率的抗氧化酶和轉錄因子，在細胞凋亡中發揮作用[13]。SIRT1表達降低，通過去乙?；疐OXO3a活性致氧化應激損傷。線粒體是人體細胞的能量庫，并認識到其在ATP和NAD+生產中的關鍵作用。高血糖癥通過電子傳遞鏈增加還原當量的穿梭，從而解除對線粒體功能的調控，并導致顯著升高活性氧生成和ATP輸出減少，增強線粒體ROS的產生，損害線粒體導致功能失調的線粒體積累，引起細胞凋亡[14]。本研究結果觀察到，高糖刺激腎小管上皮細胞發生凋亡，凋亡相關蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表達增加。然而，高糖刺激腎小管上皮細胞后，細胞發生凋亡的機制不甚清楚。同時也觀察到，高糖影響NRK52E細胞，導致PGC-1α與SIRT1的表達降低，ATP的能量供給增加，線粒體膜電位降低，凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3增加，結果表明高糖可能通過抑制PGC-1α表達，進而PGC-1α通過抑制下游的SIRT1的表達，誘導細胞凋亡發生。有研究報道，在心肌原代細胞中，PGC-1α 可顯著上調 SIRT3 的表達，并提高 SIRT3 的去乙?；富钚?，PGC-1α 可能通過上調 SIRT3 發揮心肌保護作用[15]。 在高糖處理人腎小管上皮細胞中，通過PGC-1α下調可引起足細胞凋亡[16]?？梢?，高糖刺激腎小管上皮細胞，PGC-1α可能通過SIRT3介導了細胞的凋亡。具體的機制需要體外干預實驗進一步驗證。

在DKD的早期階段，為獲得機體所需要的能量，ATP適應性的增加[17]，而在糖尿病誘導后4周，伴隨著線粒體斷裂，線粒體損傷逐漸增加，腎組織ATP含量卻逐漸減少[18]。高糖環境，通過氧化應激及細胞凋亡致線粒體功能障礙[19]。其中多種信號通過參與其調控，有研究提到，Akt活化與線粒體功能、氧化應激和凋亡有關，GSK3β是Akt下游的一種蛋白質，廣泛參與線粒體功能的調節。Akt被磷酸化激活，激活的Akt(p-Akt)可反向調節GSK3β。在糖尿病腎病，Akt磷酸化被抑制，GSK-3β被激活。然后，活化的GSK-3β調節Bax/Bcl-2的比例，使線粒體通透性增加，刺激線粒體轉換孔的開放，促進線粒體釋放細胞色素C，最終參與細胞凋亡調節，增加細胞凋亡[20]。在AKI模型的進一步研究發現，通過激活PGC-1α調控SIRT1而抑制氧化應激，可見，PGC-1α與SIRT1在AKI氧化應激中扮演重要角色[21]。在DKD中，腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調節PGC-1α信號的一個重要調節器，其磷酸化形式可通過激活下游靶SIRT1而啟動PGC-1α信號級聯[22]。SIRT1是一種NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，SIRT1具有多種生物學功能，包括抗衰老、改善糖脂代謝以及胰島素敏感性的調節。PGC-1α是SIRT1的底物，即SIRT1脫乙?；疨GC-1α，從而提高PGC-1α轉錄活性[23]。

綜上所述，SIRT1和PGC-1α可通過維護線粒體功能，PGC-1α可能上調 SIRT3 的表達，通過Akt通路進而通過減少高糖引起的NRK52E細胞凋亡損傷，對NRK52E細胞具有保護作用。