miR-27a調控Sfrp1對腎小管上皮細胞EMT的影響*

田平平， 鄒琴， 盧雨微， 郭兵， 石明雋**

(1.新鄉醫學院 三全學院 護理學院， 河南 新鄉 453003； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025)

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一類由內源基因編碼的、長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能與mRNA 3′UTR區的靶序列特異性結合，抑制靶蛋白的翻譯[1-2]，miRNA異常與多種疾病的發生發展有關[3-4]。有研究報道，在高糖培養的腎小球系膜細胞和鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎組織中miR-27a表達增加，敲低miR-27a可以抑制高糖誘導的系膜細胞增殖，也可以抑制細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相關促纖維化基因的表達[5]。分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, Sfrp1)是分泌型卷曲相關蛋白家族(secreted frizzled-related protein family, Sfrps)成員之一，亦是miR-27a最主要的靶基因[6-7]，過表達miR-27a可以抑制Sfrp1蛋白的表達[8-9]。研究發現，Sfrp1誘導了腫瘤細胞的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型[10]，EMT是上皮細胞向間質細胞轉變并執行間質細胞功能的一種形態學變化，也是促進腎纖維化進程的重要原因之一。因此，本研究擬從體外觀察過表達和敲低miR-27a后對Sfrp1及EMT相關分子表達的影響，探索在高糖環境下的miR-27a能否通過調控Sfrp1的表達影響EMT的發生，為DN的治療提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞，購自美國菌種保藏中心，ATCC)。

1.1.2主要試劑 Trizol Regent(美國ambion公司)，Sfrp1和β-actin引物(上海生工生物技術工程服務有限公司)，Revert Aid TM Firststrand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司)，2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)，miR-27a、U6引物和Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer試劑盒(廣州銳博生物公司)，pMIR-REPORT-Sfrp1野生型和突變型質粒(上海毅樂生物科技有限公司)，抗col-Ⅳ抗體(美國Sigma公司)，抗β-actin抗體(武漢普美克生物技術有限公司)，抗α-SMA抗體(武漢proteintech公司)，抗Sfrp1抗體、抗E-cadherin抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibico公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養與轉染 NRK-52E細胞置于DMEM培養基+10%胎牛血清、5%CO237 °C培養箱中培養，細胞長至70%時分為正常糖(NG組，5.5 mmol/L)和高糖(HG組，30 mmol/L)兩組，48 h后收取蛋白和RNA備用；高糖培養的NRK-52E細胞長至70%時分成miR-27amimics陰性對照組(miR-27amnc組)、miR-27amimics組(miR-27am組)、miR-27ainhibitor陰性對照組(miR-27ainc組)、miR-27ainhibitor組(miR-27ai組)，轉染4～6 h后用新鮮高糖培養基(30 mmol/L)替換原培養基，48 h后收取蛋白和RNA備用。

1.2.2Western blot法檢測Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達 按照蛋白提取試劑盒說明書提取NRK-52E細胞總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，待溴芬蘭跑至分離膠時，調電泳儀為120 V、電泳約60 min后，將其轉至預先準備好的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，一抗孵育，濃度分別為β-actin(1 ∶4 000)、Sfrp1(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶300)、α-SMA(1 ∶300)、col-Ⅳ(1 ∶1 000)；4 ℃孵育12 h；次日，TBST洗膜；二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL 液顯色，Bio-Rad凝膠成像系統掃描檢測 PVDF 膜上的目的蛋白灰度，檢測 PVDF 膜上的目的蛋白，利用Image Lab 5.1 圖像分析軟件進行分析并統計。

1.2.3實時熒光定量PCR(reverse transcriptionre realtime fluorescence quantitative,RT-qPCR )檢測miR-27a及Sfrp1 mRNA的表達 Trizol法提取NRK-52E細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，應用Bio-rad熒光定量 PCR儀檢測miR-27a及Sfrp1 mRNA的表達。miR-27a、U6引物由廣州銳博生物公司合成。β-actin、Sfrp1引物由上海生工生物技術工程服務有限公司合成。mRNA的相對表達量用2-ΔΔct方法分析。

1.2.4雙熒光素酶報告基因實驗 TargetScan 生物信息軟件預測miR-27a和Sfrp1mRNA的3′UTR區的結合位點，并由上海毅樂生物科技有限公司設計Sfrp1野生型和突變型質粒，見圖1，分別命名為pMIR-REPORT-Sfrp1野生型(wt Sfrp1-3′UTR)和pMIR-REPORT-Sfrp1突變型(mtSfrp1-3′UTR)。將NRK-52E細胞分為野生型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics陰性對照組(wtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc組)、野生型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics組(wtSfrp1-3′UTR+miR-27am組)、突變型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics陰性對照組(mtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc組)以及突變型Sfrp1-3′UTR+miR-27amimics組(mtSfrp1-3′UTR+miR-27am)。進行轉染前1天，將NRK-52E細胞鋪入24孔板中，使轉染時細胞密度達到約50%，分別取50 nmolmiR-27amimics(或)miR-27amimics negative control、海腎熒光質粒20 ng和Sfrp1野生型(或突變型)質粒200 ng 混合于DMEM培養基中，轉染4～6 h后棄去培養基，加入含2%血清的高糖培養基；48 h后按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明書操作。PBS液清洗細胞3次，吸凈24孔板中PBS液，每孔加入PLB 100 μL，于水平搖床上常溫裂解15～20 min；將裂解液吸至1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心3～5 min；吸等量上清轉移至新的1.5 mL EP管中；上機檢測，分別加入LARⅡ100μL和Stop & Glo? Buffer液100 μL，利用熒光素酶報告基因檢測儀檢測螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值進行分析。

圖1 pMIR-REPORT-Sfrp1質粒圖譜Fig.1 Vector map of pMIR-REPORT-Sfrp1

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 NG和HG組細胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達

RT-qPCR結果顯示，與NG組相比，HG組miR-27amRNA表達明顯增高(P<0.05)，而Sfrp1 mRNA表達降低(P<0.05)；見表1。Western blot結果顯示，與NG組比較，HG組Sfrp1、E-cadherin表達降低(P<0.05)，而col-Ⅳ、α-SMA蛋白表達增高(P<0.05)；見圖2、表2。

表1 NG、HG組細胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達Tab.1 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA between NG and HG

圖2 NG、HG組細胞Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(Western blot)Fig.2 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between NG and HG groups(Western blot)

表2 NG、HG組細胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達Tab.2 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between NG

2.2 miR-27a 靶向調控Sfrp1

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與wtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc 相比，wtSfrp1-3′UTR+miR-27am組的相對熒光素酶活性降低(P<0.05)；而當Sfrp1基因 3'UTR 的潛在結合位點發生點突變后，突變型質粒mtSfrp1-3′UTR+miR-27amnc與mtSfrp1-3′UTR+miR-27am組熒光素酶活性未見明顯差異，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。提示miR-27a能與Sfrp1 mRNA 3′UTR區結合，抑制Sfrp1的表達。

表3 熒光素酶報告基因檢測miR-27a靶向調控Tab.3 Luciferase reporter gene assayed-regulation of Sfrp1 by

2.3 過表達miR-27a后NRK-52E細胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達水平

RT-qPCR結果顯示，與miR-27amnc組相比，miR-27am組miR-27amRNA表達增高(P<0.05)，Sfrp1 mRNA表達降低(P<0.05)。見表4。Western blot結果顯示，與miR-27amnc組比較，miR-27am組Sfrp1、E-cadherin表達降低(P<0.05)；而col-Ⅳ、α-SMA的蛋白表達增高(P<0.05)。見圖3、表5。

表4 miR-27a mnc和miR-27a m組細胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達Tab.4 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA in miR-27a mnc and miR-27a m

圖3 miR-27a mnc和miR-27a m組細胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(Western blot)Fig.3 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a mnc andmiR-27a m groups(Western blot)

表5 miR-27a mnc和miR-27a m組細胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達Tab.5 Expression of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳprotein between miR-27a mnc and

2.4 抑制miR-27a后NRK-52E細胞中miR-27a、Sfrp1、E-cadherin、col-Ⅳ、α-SMA的表達水平

RT-qPCR結果顯示，與miR-27ainc組相比，miR-27ai組miR-27a表達降低(P<0.05)，而Sfrp1表達增高(P<0.05)。見表6。Western blot結果顯示，與miR-27ainc組比較，miR-27ai組Sfrp1、E-cadherin表達增高(P<0.05)；而col-Ⅳ、α-SMA的蛋白表達降低(P<0.05)。見圖4、表7。

表6 miR-27a inc和miR-27a i組細胞中miR-27a、Sfrp1 mRNA表達Tab.6 Expression levels of miR-27a and Sfrp1 mRNA between miR-27a inc and miR-27a i

圖4 miR-27a inc和miR-27a i組細胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達(Western blot)Fig.4 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a inc andmiR-27a i groups(Western blot)

表7 miR-27a inc和miR-27a i組細胞中Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ蛋白表達Tab.7 Expression levels of Sfrp1, E-cadherin, α-SMA, and col-Ⅳ protein between miR-27a inc and

3 討論

DN是糖尿病(diabetes mellitus, DM)所致的一種常見并發癥，也是引起終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)的常見原因[11]。大量研究表明，腎臟纖維化是導致DN和ESRD的主要病理因素[12-13]。而EMT是促進腎纖維化進程的重要原因之一[14]。當發生EMT時可引起E-cadherin表達減少或丟失，同時α-SMA表達增多。α-SMA是肌成纖維細胞的標志蛋白，肌成纖維細胞能夠分泌大量ECM并發生沉積，最終引起腎臟纖維化的發生。本研究以NRK-52E細胞為研究對象，分別給予正常糖和高糖處理48 h，結果顯示HG組E-cadherin表達減少，α-SMA、col-Ⅳ表達增多，提示高糖環境可以誘導EMT的發生，促進腎臟纖維化。

近年研究發現，在真核生物中miRNA的調控作用涉及個體發育、細胞分化、增殖、代謝、凋亡和腫瘤等。研究證實，miRNA在腎臟纖維化疾病以及糖尿病腎病中也起著重要作用，miRNA與腎臟疾病的發生有關[15-20]，是引起腎臟疾病的一個新的重要因素，但其具體調控機制仍不清楚。研究發現，miR-27a可以通過調控Sfrp1影響肝細胞癌的轉移[9]。本研究結果顯示高糖培養的NRK-52E細胞中，miR-27a表達增多，Sfrp1表達減少。雙熒光素酶報告基因實驗結果提示，在共同轉染了miR-27amimics和Sfrp1野生型質粒時，熒光活性明顯減弱；而在突變型質粒組未見明顯變化，證實miR-27a可以靶向調控Sfrp1。

Sfrp1是Wnt信號通路抑制因子之一[21-22]。本課題組前期研究結果發現，在糖尿病腎病大鼠腎組織中，Sfrp1 mRNA和蛋白表達較正常組大鼠均減少，導致Wnt信號通路活化并促進了腎臟纖維化的發生[23-24]。也有研究發現， 在結直腸癌中，Sfrp1可能通過 Wnt/β-catenin 信號通路EMT 的過程[25]。但Sfrp1調控EMT過程的具體機制仍不清楚。為進一步證實miR-27a是否通過靶向調控Sfrp1對腎小管上皮細胞EMT產生影響，本研究分別將高糖培養的NRK-52E細胞轉染miR-27amimics和inhibitor，結果發現在過表達miR-27a后，Sfrp1表達減少，E-cadherin表達降低，α-SMA、col-Ⅳ表達增多；在miR-27a抑制劑組，Sfrp1、E-cadherin、α-SMA、col-Ⅳ表達水平發生了相反的變化。說明過表達miR-27a可以抑制Sfrp1的表達進而促進高糖狀態下NRK-52E細胞EMT的發生；而抑制miR-27a后，可逆轉這一現象，進一步證實了miR-27a可以通過調控Sfrp1的表達進而影響高糖誘導的NRK-52E細胞EMT進程。

綜上所述，高糖環境下，NRK-52E細胞中miR-27a可以靶向調控Sfrp1的表達，影響EMT的發生，從而參與糖尿病腎病腎臟纖維化的過程。