田平平, 鄒琴, 盧雨微, 郭兵, 石明雋**
(1.新鄉醫學院 三全學院 護理學院, 河南 新鄉 453003; 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 病理生理學教研室, 貴州 貴陽 550025)
微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一類由內源基因編碼的、長度為19~25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,能與mRNA 3′UTR區的靶序列特異性結合,抑制靶蛋白的翻譯[1-2],miRNA異常與多種疾病的發生發展有關[3-4]。有研究報道,在高糖培養的腎小球系膜細胞和鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)大鼠腎組織中miR-27a表達增加,敲低miR-27a可以抑制高糖誘導的系膜細胞增殖,也可以抑制細胞外基質(extracellular matrix,ECM)相關促纖維化基因的表達[5]。分泌型卷曲相關蛋白1(secreted frizzled-related protein 1, Sfrp1)是分泌型卷曲相關蛋白家族(secreted frizzled-related protein family, Sfrps)成員之一,亦是miR-27a最主要的靶基因[6-7],過表達miR-27a可以抑制Sfrp1蛋白的表達[8-9]。研究發現,Sfrp1誘導了腫瘤細胞的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型[10],EMT是上皮細胞向間質細胞轉變并執行間質細胞功能的一種形態學變化,也是促進腎纖維化進程的重要原因之一。因此,本研究擬從體外觀察過表達和敲低miR-27a后對Sfrp1及EMT相關分子表達的影響,探索在高糖環境下的miR-27a能否通過調控Sfrp1的表達影響EMT的發生,為DN的治療提供新的依據。
1.1.1細胞來源 大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E細胞,購自美國菌種保藏中心,ATCC)。
1.1.2主要試劑 Trizol Regent(美國ambion公司),Sfrp1和β-actin引物(上海生工生物技術工程服務有限公司),Revert Aid TM Firststrand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo公司),2×SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司),miR-27a、U6引物和Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer試劑盒(廣州銳博生物公司),pMIR-REPORT-Sfrp1野生型和突變型質粒(上海毅樂生物科技有限公司),抗col-Ⅳ抗體(美國Sigma公司),抗β-actin抗體(武漢普美克生物技術有限公司),抗α-SMA抗體(武漢proteintech公司),抗Sfrp1抗體、抗E-cadherin抗體(北京博奧森生物技術有限公司),DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibico公司)。……