CK18基因的原核表達及蛋白純化*

倪佳， 王偉,， 徐瑩瑩， 陳相屹， 張欣， 孫達權**

(1.貴陽市婦幼保健院 & 貴陽市兒童醫院 兒童重癥監護病房， 貴州 貴陽 550001； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025； 3.寧波市第一醫院 疝肝膽肛腸外科， 浙江 寧波 315000)

細胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)基因位于12q13.13，可編碼含有430個氨基酸殘基的細胞骨架蛋白，其編碼的蛋白可分為3個區域：中央區域為相對保守的α-螺旋桿狀結構域，氨基端和羧基端均為高度可變的非螺旋結構域[1]，各種翻譯后修飾多發生于該蛋白的兩端[2]。在細胞內，CK18通常與CK8按1 ∶1的比例結合而形成非共價異二聚體，并進一步組裝成角蛋白絲，用于維持細胞形態，并在細胞增殖[3]、遷移[4]、侵襲[5]、上皮-間充質轉換[6]、對抗外界應力[7]和調控細胞凋亡[8]中扮演著重要的角色。有研究表明，CK18不僅能夠通過糖基化[9]、甲基化[10]等翻譯后修飾調節角蛋白絲的溶解度和穩定性，還能被PKCε等蛋白激酶結合并磷酸化[11]，從而調控角蛋白纖維重組，參與細胞多種生理調節和病理應答。為此，本研究欲通過克隆人CK18基因和獲得CK18蛋白，為體外分析CK18蛋白與蛋白激酶PKCε之間的關系奠定前期基礎，并為將來研究CK18蛋白對細胞突觸和極性形成的影響奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞株SMMC-7721于2011年購自中國科學院上海細胞庫，并長期保存于本實驗室；RPMI-1640細胞培養液購自美國GIBCO公司，新生牛血清購自北京索萊寶，TRizol購自美國Invitrogen公司，高保真反轉錄試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pMD18-T載體、T4 DNA ligase、限制性核酸內切酶購自大連寶生物公司，質粒小量提取試劑盒、感受態細菌DH5α和Rosetta(DE3)購自北京天根生物公司，谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase，GST)親和純化樹脂(Glutathione-Sepharose 4B)購自Pharmacia公司，GST標簽抗體、CK18及其磷酸化抗體和PKCε抗體購自南京巴傲得公司，BCA定量試劑盒購自Pierce公司，原核表達的蛋白激酶PKCε由本實驗室自制凍存。CK18引物合成及DNA測序由上海生工生物完成。

1.2 研究方法

1.2.1聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增及DNA片段TA克隆 將肝癌細胞系SMMC-7721培養于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液中，并置于37 ℃、5% CO2的環境中培養；待細胞融合至80%時，用TRizol法抽提細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒將mRNAs反轉錄成cDNAs。根據GenBank中人CK18基因序列(NM_000224)設計PCR引物如下：上游引物5′-TGAATTCATGAGCTTCACCACTCGCTCCACCT-3′，下游引物5′-TCTCGAGTTAATGCCTCAGAACTTTGGTGTCAT-3′。以cDNAs為模板，加入引物及高保真DNA聚合酶，PCR擴增CK18基因蛋白編碼區DNA片段。反應條件為：95 ℃預變性2 min、95 ℃變性15 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min、30個循環，72 ℃穩定10 min；然后加入Z-Taq DNA聚合酶，按上述反應程序繼續反應4個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段并進行TA克隆，用連接產物轉化感受態細菌DH5α，并涂布于含氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)固體培養基平板上進行篩選培養。挑取陽性克隆并擴大培養，按質粒小量提取試劑盒說明抽提質粒。經EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定及DNA測序鑒定，將序列正確的重組質粒命名為pMD18T-CK18GST。

1.2.2pGEX-CK18GST原核表達質粒的構建 分別對原核表達載體pGEX-4t-1及含有目的基因片段的pMD18-CK18GST進行EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，回收骨架載體片段和目的基因片段；將目的基因片段CK18GST與有相應切口的pGEX-4t-1在4 ℃下連接過夜，連接產物導入感受態細菌DH5α中，經篩選培養、挑取單克隆、抽提質粒和酶切鑒定，重組質粒命名為pGEX-CK18GST。

1.2.3原核誘導表達融合蛋白CK18及其鑒定 用重組原核表達質粒pGEX-CK18GST轉化感受態細菌Rosetta(DE3)，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基上篩選培養，挑取單克隆并進行擴大培養，而后吸取1 mL菌液加入到200 mL LB培養基中。200 r/min、37 ℃下搖至菌液OD450 nm為0.4時，調節溫度至23 ℃，加入10 mmo/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)繼續培養2 h，誘導目的蛋白表達。收集誘導前/后的菌液并制樣，分別用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)、考馬斯亮藍染色及western blot檢測融合蛋白(GST-CK18)在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導下的表達情況。

1.2.4融合蛋白GST-CK18的純化及鑒定 誘導后的菌液在12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集離心沉淀的細菌，并用含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和1% Triton X-100的PBS重懸(按100 mL菌液沉淀，加5 mL PBS的比例重懸)。用均質儀破碎細菌，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色及Western blot，檢測融合蛋白是否可溶。若為可溶性蛋白，直接用GST純化柱純化上清液；若為包涵體蛋白，先用PBS清洗沉淀3次，再用8 mol/L尿素(含1 mmol/L DTT)溶解包涵體，放入透析袋中，依次在6 mol/L尿素溶液(0.1 mmol/L DTT)、4 mol/L尿素溶液(0.1 mmol/L DTT)、2 mol/L尿素溶液(0.1 mmol/L DTT)和清水中4 ℃透析48 h，收集透析袋中的清液，用GST純化柱純化。GST純化柱純化蛋白(在4 ℃環境中操作)：(1)平衡吸附柱，加入5倍柱體積的PBS平衡；(2)上樣，取2倍柱體積的樣品進行上樣、重復過柱3次后棄去；(3)洗滌，以10倍柱體積的PBS洗去非特異性雜蛋白；(4)洗脫目的蛋白，加入2倍柱體積的10 mmol/L谷胱甘肽洗脫液、孵育10～15 min、重復過柱3次后收集、-80 ℃保存；(5)再生吸附柱，加入2倍柱體積0.1 mol/L Tris-Cl/0.5 mol/L NaCl溶液(pH 8.4)后、再加入2倍柱體積0.1 mol/L NaAc/0.5 mol/L NaCl溶液(pH 4.5)、重復上述兩步操作4次；(6)平衡并保存吸附柱，以20倍柱體積PBS平衡吸附柱、再加入2倍柱體積的20%乙醇洗滌、用20%乙醇填充吸附柱、并于4 ℃存放。取洗脫液制樣，進行SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色及Western blot，檢測蛋白純化效果。

1.2.5SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色及Western blot 樣品經brandford法定量后制樣，左右對稱上樣，進行SDS-PAGE。電泳結束后，切取一側變性膠用于考馬斯亮藍染色，先經固定液固定30 min，再用考馬斯亮藍R-250染色液染色30 min，最后用漂洗液漂洗至條帶清晰；另一側變性膠則用于Western blot，將膠中蛋白電轉印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，經5%脫脂牛奶封閉、TBST洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜等操作后，用電化學發光液(electrochemiluminescence，ECL)在多功能成像系統中成像。

1.2.6體外CK18磷酸化位點分析 取2個1.5 mL的離心管，將純化的CK18蛋白、65 ℃蛋白酶滅活的細胞內容物提取液、四種核苷三磷酸(NTPs)，再在其中一個離心管中加入本實驗室自制的蛋白激酶PKCε，混合均勻后放入37 ℃金屬浴反應6 h。反應結束后加入5×變性膠上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min。SDS-PAGE電泳后，使用抗體pS33-CK18和pS52-CK18進行分析。

1.2.7細胞免疫熒光染色及激光掃描共聚焦顯微分析 免洗蓋玻片高壓滅菌后放入細胞培養板24孔板，將過表達PKCε的肝癌細胞低密度鋪板于蓋玻片上；培養1周后，用PBS清洗細胞3次，并用4%多聚甲醛室溫下固定30 min；然后，用1% TritonX-100室溫下通透細胞膜15 min。并用5% BSA在37 ℃中封閉1 h；將蓋玻片置于濕盒中，蓋玻片上滴加按1 ∶100稀釋的一抗50 μL，4 ℃孵育過夜；再滴加按1 ∶100稀釋的熒光二抗，4 ℃孵育4 h；用含4,6-二脒基-2-苯基吲哚,二氫氯化物(DAPI)的抗熒光淬滅封片劑封片，并用無色指甲油固定蓋玻片后在4 ℃暗盒中過夜。熒光染色片子用激光共聚焦掃描顯微鏡拍照記錄。

2 結果

2.1 pGEX-CK18GST原核表達質粒的建立

高保真PCR擴增獲得的CK18GSTDNA片段經TA克隆后獲得含有目的基因的克隆質粒pMD18T-CK18GST(圖1A)。用EcoRⅠ/XhoⅠ對pMD18-CK18GST進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示pMD18-CK18GST被分為2個條帶：1條分子量約2.6 kbp的pMD18-T載體骨架DNA和1條分子量約1.3 kbp的目的基因CK18GSTDNA片段(圖1A)。DNA測序結果顯示，該CK18GSTDNA片段正是CK18蛋白編碼區DNA片段(圖1B)。將該DNA片段通過EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位點導入原核表達載體pGEX-4t-1中，構建了原核表達質粒pGEX-CK18GST(圖1C)，用EcoRⅠ/XhoⅠ對其進行雙酶切鑒定，其兩條DNA片段的長度與預計的大小一致(圖1D)，證明pGEX-CK18GST構建成功。

注：A為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切pMD18T-CK18GST克隆質粒，B為pGEX-CK18GST原核表達質粒圖譜,C為EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切原核表達質粒pGEX-CK18GST，D為CK18基因的DNA測序結果。圖1 CK18基因克隆及其原核表達載體pGEX-CK18GST構建Fig.1 The construction of CK18 gene cloning and its prokaryotic expression vector pGEX-CK18GST

2.2 誘導目的蛋白GST-CK18原核表達及其蛋白純化

原核表達質粒pGEX-CK18GST導入細菌Rosetta(DE3)后，用IPTG誘導目的融合蛋白GST-CK18表達。經SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，其結果如圖2所示，考馬斯亮藍染色可見分子量70 kDa之上有蛋白表達增加(泳道1～2)，而Western blot結果也顯示同一位置GST融合蛋白(GST-CK18)的表達量也隨之升高(泳道1～2)。由于融合蛋白中GST標簽是由239個氨基酸殘基組成，目的蛋白CK18由430個氨基酸殘基組成，故融合蛋白理論相對分子質量為76 kDa，目的條帶的分子量大小與預期相符，證明融合蛋白GST-CK18在IPTG誘導下大量表達。對誘導后的菌體蛋白進行分析，發現GST-CK18同時出現于沉淀和溶液中(泳道3～4)，證明部分GST-CK18具有可溶性。對上清液中的GST-CK18進行GST親和層析，獲得純化的目的蛋白CK18(泳道5)。

注：A為變性膠的考馬斯亮藍染色結果，B為對應的Western blot結果；M為Thermo Scientific PageRuler Pierce 26616，1為未誘導的細菌全蛋白，2為IPTG誘導后的細菌全蛋白，3為菌體破碎后的沉淀物，4為菌體破碎后的上清液，5為GST親和純化的目的蛋白。圖2 融合蛋白GST-CK18的考馬斯亮藍染色及Western blot分析Fig.2 Coomassie blue staining and Western blot analysis of the fusion protein GST-CK18

2.3 CK18的Ser52磷酸化可引起細胞形態變化

將體外純化的CK18蛋白與蛋白激酶PKCε在體外37 ℃共孵育，發現CK18的Ser52能夠發生磷酸化修飾，而該蛋白的Ser33未發生磷酸化修飾(圖3A)。為進一步觀察PKCε對CK18的作用，對過表達外源PKCε的肝癌細胞進行Western blot分析，發現過表達PKCε的肝癌細胞內CK18的Ser52磷酸化水平進一步提高(圖3B)，提示PKCε能夠調控細胞骨架蛋白CK18的Ser52磷酸化修飾。將表達外源PKCε的肝癌細胞鋪板于蓋玻片上培養后，用抗pS52-CK18抗體進行免疫熒光染色，結果顯示當細胞內pS52-CK18與PKCε多處存在共定位，且細胞由原來的多邊形變成具有許多突起的類似于樹突狀細胞，細胞形態明顯發生改變(圖3C)。

注：A為蛋白激酶PKCε可以在體外使CK18 Ser52磷酸化，B為細胞內過表達蛋白激酶PKCε促進細胞內CK18 Ser52磷酸化水平，C為細胞內CK18 Ser52與PKCε在細胞內共定位并引起細胞形態變化。圖3 CK18 Ser52磷酸化引起細胞形態變化Fig.3 Changes in cell morphology caused by phosphorylation of CK18 Ser52

3 討論

CK18屬于Ⅰ型細胞角蛋白，是細胞中間絲蛋白和骨架蛋白的主要成分之一，主要參與調控細胞極性等多種生理，這些調控作用基本上都是通過對CK18蛋白翻譯后修飾而實現的[12-14]。這種翻譯后修飾具有多樣性，包括最重要的磷酸化、O-連接的糖基化、乙酰化與甲基化、轉酰胺基修飾等[15-17]。這些翻譯后修飾中最常見和最多的是磷酸化修飾。CK18有多個磷酸化修飾位點(Ser7、Ser33、Ser34、Ser52、Ser53)[15-16]。有研究指出，CK18的Ser33常發生磷酸化修飾，當Ser33發生磷酸化修飾后，CK18就可以與14-3-3蛋白結合，使CK18的亞細胞定位發生變化，從而參與調控肝細胞的有絲分裂[18]。然而，Ser52才是CK18磷酸化的主要生理位點，研究顯示肝細胞中CK18 Ser52高度磷酸化與乙肝病毒、丙肝病毒等感染有密切聯系[19]。此外，還有研究顯示在S期和G2/M期時CK18 Ser52的磷酸化水平可上升至G1期的3～4倍，并主要分布于母中心粒近端，而將該位點由絲氨酸突變為丙氨酸后會導致子母中心粒分離和微管成核，最終抑制細胞分裂。這些結果提示母中心粒Ser52磷酸化狀態在維持母子中心粒之間的緊密結合和微管成核中起著關鍵作用[20]。

鑒于CK18翻譯后磷酸化修飾對細胞的重要生理調控，本研究在之前的研究基礎上[3]，又在本研究中克隆了CK18基因的蛋白編碼區，構建重組原核表達質粒pGEX-CK18GST，用原核表達的方式成功誘導重組蛋白CK18，用親和層析的方法純化了該蛋白，并發現蛋白激酶PKCε能夠促進CK18 Ser52磷酸化水平，導致細胞內骨架發生重排，最終導致細胞表面突起形成和細胞形態改變。這些研究和純化的CK18蛋白為接下來研究CK18其他位點的翻譯后修飾和肝癌細胞表型之間的關系奠定了一定的基礎。此外，本組還克隆和純化了蛋白激酶ERK1/2和PKCε，為接下來系統研究ERK1/2、PKCε和CK18三者之間的關系以及它們之間對細胞形態重塑和細胞極性的影響做好了前期準備。