斑馬魚早期胚胎發育過程中IL-1β表達的特點*

趙硯馳， 李化， 李丹， 楊雁竹， 楊曉鳳， 黃江濤， 莫大雙， 舒莉萍*

(貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫學教研室，細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室， 貴州省再生醫學重點實驗室， 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 中國醫學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

20世紀40年代在研究發熱的機制過程中，研究人員發現激活的白細胞可以釋放一種誘導發熱的因子，將其命名為白細胞介素1(interleukin 1，IL-1)[1]，可分為IL-1α與IL-1β，其中IL-1β由巨噬細胞、內皮細胞、T淋巴細胞(T-lymphocyte，TL)及B淋巴細胞(B-lymphocyte，BL)等分泌并作用于其他細胞發揮促炎效應，是炎癥免疫反應發生和發展的重要調控因子[2-3]。IL-1β可通過自分泌與旁分泌的方式刺激T細胞活化和B細胞的分化，還能促進單核細胞、巨噬細胞等抗原呈遞功能[4]。有研究發現IL-1β是核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路的下游效應因子，是炎癥的重要生物標志物[5]。IL-1β能通過血液循環到達全身，作用于下丘腦發揮致熱效應以及刺激下丘腦-垂體釋放糖皮質激素，進而針對IL-1β發揮負反饋調節作用[6]。隨著對IL-1β的深入研究，發現IL-1β除了參與免疫調節功能，還參與造血、內分泌及神經系統等多種病理生理過程[7]；IL-1β在哺乳類動物胚胎發育中同樣起著重要作用，與胚胎數量及胚胎形態呈正相關關系，小鼠體內使用IL-1受體拮抗劑可以阻斷胚胎的順利著床[8]；IL-1β可通過調控胚胎發育的質量影響妊娠的情況，如檢測培養液中的IL-1β可評估胚胎發育的潛能與質量[9-11]。研究在小鼠、兔子等動物模型中探索IL-1β的功能，但是由于小鼠、兔子等動物模型的飼養成本高昂、繁殖周期較長以及胚胎為宮內發育等特點，無法高通量高效且清晰直觀的探究IL-1β在動物體內的變化情況[12-13]。新型模式生物斑馬魚具有體型小、繁殖能力強、體外受精且胚胎透明、易于基因編輯等優勢，尤其是其全基因組測序工作已經完成，發現其具有與人類高度保守的發育與疾病基因[14-16]，然而尚未查到有斑馬魚早期胚胎發育過程中IL-1β表達情況的研究，因此本研究將斑馬魚中IL-1β氨基酸序列與人類等9個不同物種IL-1β氨基酸序列進行同源性分析，并在斑馬魚胚胎早期發育過程中探究IL-1β的表達特點，為IL-1β相關疾病的研究提供實驗與理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 選用野生型斑馬魚4 ～ 72 受精后小時(hourspost-fertilization，hpf )的胚胎，該品系名稱為Tüebingen，屬于本實驗室自行繁殖培育，合格證號為[ SYXK(黔)2018-0001 ]。

1.1.2細胞及主要試劑 大腸桿菌(Escherichiacoil，E.coli)DH5α感受態細胞、Taq 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)預混液、質粒小提試劑盒(北京天根生化)，First Strand 互補脫氧核糖核酸(complementary DNA, cDNA)Synthesis Kit、限制性內切酶NotⅠ和限制性內切酶EcoRⅠ、T4 DNA連接酶(美國ThermoFisher)，pGEM-T載體(pGEM-TVector)、T3聚合酶(T3 RNA Polymerase，美國Promega)，DIG RNA Labeling Mix(德國Roche)，原位雜交染色試劑盒BCIP/NBT(美國Vector Lab)；TRIzol Reagent(美國ambion)，ProbeQuantTMG-50 Micro Columns(英國cytiva)。

1.1.3主要儀器 分子雜交箱HL-2000(美國UVP)，PCR儀etc811(北京東勝創新)，高速冷凍離心機(安徽中科中佳)，體視顯微鏡SMZ25(日本尼康)。

1.2 實驗方法

1.2.1斑馬魚養殖 野生型斑馬魚(Tüebingen品系)于室溫(26±2)℃且12 h/12 h照明的循環水系統中養殖，斑馬魚胚胎培養于培養液(0.06 g/L海鹽、0.5mg/L亞甲基藍)中。

1.2.2斑馬魚IL-1β基因氨基酸同源性分析及系統進化樹繪制 在美國國家生物信息技術中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的數據庫中查詢IL-1β在人類、斑馬魚、豬、綿羊、水牛、小鼠、大鼠、家兔以及豚尾猴的氨基酸序列，通過多重序列比對軟件(multiple sequence alignment，DNAMAN)進行氨基酸序列的相似性比對，最后通過分子進化遺傳分析軟件(molecular evolutionary genetics analysis X，MEGA X)制作系統進化樹，選用算法Neighbor-joining進行評估。

1.2.3斑馬魚總RNA提取及cDNA合成 分別收集4組72 hpf斑馬魚胚胎(25枚/組)，TRIzol處理、氯仿抽提、異丙醇沉淀，所得產物用75%乙醇洗滌，加適量焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解；將上述總RNA進行逆轉錄得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.4地高辛標記的IL-1β反義信使RNA(messenger RNA，mRNA)探針制備 根據斑馬魚IL-1β基因序列使用Snap Gene軟件設計引物：F端為TGAGAAAGCAGAGGAACTTAACC，R端為AATTAACCCTCACTAAAGGGCGAATCTTCATACGCGGTG(劃線位置表示添加的T3啟動子序列)。使用T4DNA連接酶將NotⅠ與EcoRⅠ雙酶切后的pGEM-T載體產物與同樣限制性內切酶雙酶切的IL-1β片段產物進行質粒重組，瓊脂糖凝膠電泳與測序鑒定無誤后，利用EcoRⅠ將pGEM-T-IL-1β線性化，使用T3轉錄體系進行體外轉錄，純化所得產物后得到反義mRNA探針，置于-80 ℃凍存。

1.2.5斑馬魚全胚胎原位雜交 分別收集4、6、9、12、18、24、48及72 hpf的斑馬魚胚胎，25枚/組。利用4%多聚甲醛(paraformaldehyde fixative solution，PFA)固定胚胎過夜，甲醇梯度脫水，-20 ℃保存；復水，蛋白酶K處理48 hpf和72 hpf胚胎，其余時間的胚胎無需蛋白酶K處理；所有樣本胚胎于分子雜交箱中68 ℃預雜交4 h；加地高辛標記的IL-1β反義mRNA探針雜交14 h；第2天檸檬酸鈉(saline sodium citrate，SSC)緩沖液洗滌，加抗地高辛堿性磷酸酶抗體(antisense digoxigenin alkaline phosphatase，anti-DIG-AP；1 ∶5 000)于4 ℃孵育16 h；第3天含Tween-20的馬來酸緩沖液(maleic acid buffer-tween，MABT)洗滌，加新鮮配置的BCIP/NBT染液，避光染色直至陽性雜交信號出現，立即使用PBST洗滌終止染色，4% PFA固定，于體視顯微鏡下進行觀察。

2 結果

2.1 不同物種間IL-1β的生物信息學特征

通過對人類、斑馬魚、小鼠、家兔及豬等9個物種的IL-1β氨基酸序列進行相似性比對，結果顯示斑馬魚IL-1β氨基酸序列與人類、小鼠、家兔以及豬等9個物種相似度較高(圖1)；后續繪制9個物種的IL-1β系統進化樹(圖2)，結果表明在斑馬魚進化過程中與哺乳類動物具有一定保守性。

2.2 pGEM-T- IL-1β重組質粒構建及鑒定結果

使用氨芐抗性篩選的pGEM-T-IL-1β重組質粒經過限制性內切酶雙酶切后，將雙酶切鑒定結果正確的產物進行測序鑒定，將測序結果與已知斑馬魚IL-1β基因序列比對，結果保持一致。見圖3和圖4。

2.3 野生型斑馬魚胚胎早期發育過程中IL-1β基因的表達

全胚胎原位雜交實驗結果表明，4 hpf野生型斑馬魚胚胎中開始觀察到IL-1β陽性雜交信號表達；6～12 hpf野生型斑馬魚胚胎可見IL-1β廣泛表達的陽性雜交信號，12 hpf胚胎中表達尤為明顯；18 hpf野生型斑馬魚胚胎軀干背側、眼睛以及胚胎中后部的中間細胞群(intermediate cell mass, ICM)等部位觀察到不同程度的IL-1β陽性雜交信號表達；24 hpf野生型斑馬魚胚胎整胚中可見IL-1β表達，頭部、眼睛及心臟部位觀察到強雜交信號；48～72 hpf野生型斑馬魚胚胎軀干部位的肌肉組織中IL-1β表達尤為明顯。見圖5。

注：英文字母表示不同氨基酸序列，數字表示氨基酸序列號，*表示相同氨基酸序列，.或∶表示不同相似程度的氨基酸序列；-表示該物種與其余物種對比缺失的氨基酸序列片段。圖1 不同物種間IL-1β氨基酸序列的比對Fig.1 Alignment of IL-1β amino acid sequences from multiple species

注：結點上方數字為自展值，表示該進化分支的可信度。圖2 不同物種間IL-1β的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of IL-1β in multiple species

注：M為DNA Marker Ⅲ，1～4分別為重組質粒pGEM-T- IL-1β。圖3 pGEM-T- IL-1β重組質粒EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切產物電泳鑒定結果Fig.3 Electrophoresis result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid digested with EcoRⅠ and NotⅠ enzyme

注：紅色方框表示所選取限制性內切酶及堿基序列，黑色箭頭表示所指限制性內切酶位點；紅色曲線表示胸腺嘧啶，綠色曲線表示腺嘌呤，藍色曲線表示胞嘧啶，黑色曲線表示鳥嘌呤。圖4 pGEM-T-IL-1β重組質粒測序結果Fig.4 Sequencing result of pGEM-T-IL-1β recombinant plasmid

注：黑色箭頭表示IL-1β表達最為突出部位。圖5 野生型斑馬魚胚胎發育過程中不同時間點IL-1β的表達(全胚胎原位雜交，×80)Fig.5 Expression of IL-1β during embryonic development of wild-type zebrafish at different time (The whole embryo in situ hybridization,×80)

3 討論

IL-1β是近年來研究受到熱烈關注的細胞因子之一，當其與相應受體結合后可在信息傳遞以及激活調節免疫細胞等方面發揮作用，可以刺激機體組織產生炎癥以及防御反應[17-19]。例如可導致NF-κB經典信號通路被激活，IκB蛋白降解后使得二聚體得到釋放，使得p65磷酸化激活進入細胞核調控基因轉錄[20-21]；IL-1β還能通過激活p38以及JNK信號通路，促進細胞的增殖[21-22]。早期有研究發現在小鼠胚胎不同發育階段中，檢測到IL-1β在4細胞期、8細胞期及囊胚中出現mRNA水平表達，此外還有研究發現IL-1β蛋白在胚胎所有階段均有表達，并且伴隨著胚胎成熟蛋白表達逐漸增加[23]。

本研究生物信息學分析結果表明，斑馬魚IL-1β氨基酸序列與人類IL-1β氨基酸序列相似度較高，從而提示了斑馬魚IL-1β與人類IL-1β功能相似，并在進化過程中斑馬魚與哺乳類動物保守性較高；通過成功構建pGEM-T-IL-1β重組質粒，制備地高辛標記的IL-1β反義mRNA探針進行全胚胎原位雜交實驗結果顯示，IL-1β在4 hpf斑馬魚胚胎中觀察到陽性雜交信號，12 hpf胚胎中廣泛表達，18 hpf胚胎軀干背側以及眼睛等部位表達外、在中后部的ICM中同樣觀察到IL-1β的陽性雜交信號。由于ICM是斑馬魚胚胎發育過程中原始造血發生的重要區域之一，相當于哺乳類動物胚胎中的卵黃囊，含有大量原始造血細胞，ICM中的后部造血島位于尾部腹側區，標志著原始造血的結束[24-25]，因此結果提示IL-1β可能與胚胎早期造血發育密切相關。24、48及72 hpf時，IL-1β表達逐漸從斑馬魚胚胎頭部延伸至全身軀干，幾乎在所有細胞中表達，其中在肌肉組織中表達尤為明顯，提示IL-1β可能是斑馬魚早期胚胎發育的重要因子。

近年來模式動物已被作為研究和解釋基因功能的手段，被廣泛用于相關疾病模型研究，而斑馬魚在基因上的高度保守性，使其彌補了非脊椎動物與哺乳類動物之間的“空隙”，以及疾病建模技術的發展，例如可以采用成簇的規律間隔的短回文重復序列/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)與嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino, MO)等技術的出現，使得利用斑馬魚建立疾病模型方法更為成熟[26]。本研究通過分析斑馬魚胚胎早期發育中不同時期IL-1βmRNA的表達情況，有助于在相關疾病的斑馬魚模型中更好地探索IL-1β的功能和作用。

綜上所述，本研究不僅通過生物信息學分析了斑馬魚IL-1β氨基酸序列在進化過程中具有相對保守性，并且通過全胚胎原位雜交實驗發現IL-1β的表達貫穿斑馬魚早期胚胎發育過程，提示IL-1β可能在斑馬魚早期胚胎發育中起著重要作用，為進一步探索IL-1β在相關疾病中的作用提供了實驗基礎。