毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取工藝*

計瑋瑋，俞婷婷，李 穎**，朱 煒，沈曉利，王勇軍

（1.湖州市梁希森林公園管理處，浙江 湖州 313022；2.湖州市生態林業保護研究中心，浙江 湖州 313013；3.長興縣林業技術推廣中心，浙江 湖州313199）

竹蓀（Dictyophora indusiata）屬鬼筆科（Phauaceae）竹蓀屬（Dictyophora），別名竹笙、竹參，外形優美，營養豐富，有“菌中皇后”的美稱[1-2]。竹蓀具有補氣養陰、潤肺止咳、清熱利濕的功效。其子實體中富含黃酮、多糖、多酚等生物活性物質，并含有多種氨基酸及多種維生素，具有提高免疫力、抗癌、抗氧化等作用[3-4]。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性功能[5-6]。黃酮類化合物常采用乙醇等有機溶劑進行提取，也可采用超聲波、微波等設備加以輔助提取[7]。

浙江省是全國重點毛竹（Phyllostachys edulis）主產區，近年來，隨著浙江省毛竹林高質量發展提升工程的實施，毛竹林下栽培竹蓀等食用菌模式在浙江省毛竹林區推廣迅速。在毛竹林下人工栽培竹蓀，不與糧爭田，不與果爭地，是林下經濟產業的重要組成。在收獲竹蓀的同時，栽培后的廢料又可以作為林地的天然有機質肥料，有效改善林中土壤結構和肥力，實現林-菌生態循環技術模式，是集經濟效益、生態效益和社會效益于一體的短平快山區經濟發展項目。

以毛竹林下人工栽培的竹蓀子實體為原料，在單因素試驗的基礎上，采用響應面優化法對毛竹林下栽培的竹蓀子實體總黃酮的提取工藝條件進行優化。研究毛竹林下栽培竹蓀中總黃酮的高效提取方法，有益于提升竹蓀附加值，可為毛竹林下仿野生生態栽培竹蓀的精深加工和開發利用提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

竹蓀子實體，浙江省湖州市毛竹林下栽培；蘆丁標準品（純度≥98%），NaOH、Al（NO3）3、NaNO2等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

JDS-82A電熱恒溫振蕩水槽，常州金壇精達儀器制造有限公司；R-210型旋轉蒸發儀，瑞士步琪有限公司；紫外分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線繪制

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定總黃酮含量[8]。精密稱取105℃真空干燥至恒重的蘆丁標準品25 mg，用70%乙醇將其溶解并定容至50 mL，搖勻，得0.5 mg·g-1的蘆丁標準液。分別精密移取上述標準液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于50 mL容量瓶，加2 mL~4 mL蒸餾水，加5%的亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置6 min。加入10%的硝酸鋁0.4 mL，搖勻，放置6 min。加入4%的氫氧化鈉4.0 mL，再加蒸餾水至刻度、搖勻，放置15 min。以空白試劑作對比參照，在510 nm處測定吸光度，以質量濃度C（μg·mL-1）為橫坐標、吸光度值A為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮的提取

將收集的毛竹林下栽培竹蓀子實體真空烘干后粉碎，過40目篩，得毛竹林下栽培竹蓀子實體粉末。準確稱取2.0 g毛竹林下栽培竹蓀子實體粉末置于磨口錐形瓶中，按照要求加入一定量的乙醇溶液，在一定溫度下回流提取2 h。抽濾用80%乙醇定容至100 mL，取1.5 mL待測液于100 mL容量瓶中，按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟測定吸光度A。毛竹林下栽培竹蓀子實體中總黃酮提取量（Q，mg·g-1）的計算公式為：

式中：ρ為待測液濃度（mg·mL-1）；n為提取液稀釋因子；V為提取液體積（mL）；W為原料質量（g）。

1.3.3 提取條件的單因素試驗

稱取適量干燥粉碎后的毛竹林下栽培竹蓀子實體2.0 g，選取提取溫度、乙醇體積分數、料液比3個影響因素進行單因素試驗設計。以總黃酮提取量為判斷標準，按照1.3.2中的方法進行提取。固定提取溫度為60℃，液料比為30∶1，分別在不同乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）條件下回流提取1 h，研究不同乙醇體積分數對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響；將液料比設置為30∶1，乙醇體積分數設置為70%，并分別在以下溫度梯度下（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）進行回流提取1 h，探究不同提取溫度對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響。將乙醇體積分數和提取溫度分別設置為70%和60℃，分別在以下液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）下回流提取1 h，研究溶液中不同液料比對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響。試驗數據取3組重復試驗的平均值。

1.3.4 響應面法分析試驗

在單因素試驗數據分析的基礎上，采用響應面設計里的Box-Behnken中心組合試驗設計原理，最適水平范圍選定提取溫度、液料比、乙醇體積分數3個因素綜合確定的范圍，并運用Design Expert 8.05軟件對試驗數據進行全面的分析，響應面設計選取3因素3水平。自變量試驗水平以-1，0，1分別進行編碼，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計各因子及其水平Tab.1 Factors and its levels of response surface experimental design

2 結果與分析

2.1 總黃酮提取工藝

2.1.1 單因素試驗結果

不同提取溫度對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響結果見圖1。

圖1 提取溫度對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由圖1可知，在其他因素不變的前提下，在溫度為40℃~70℃范圍內，隨著提取溫度升高，總黃酮提取量逐漸增大，在70℃時總黃酮提取量達到最高；之后隨著提取溫度進一步升高，總黃酮提取量開始下降。這可能是由于黃酮類物質是一類對溫度敏感的化合物，溫度過高會引起部分總黃酮類物質結構分解、破壞，或溶液中的其他雜質溶出量增大，從而導致總黃酮類物質的提取量下降[9]。綜合考慮，工藝優化試驗中提取溫度參數采用60℃、70℃、80℃作為響應面分析中該因素的3個水平。

不同乙醇體積分數對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響結果見圖2。

由圖2可知，在其他因素不變的前提下，乙醇體積分數在50%~80%時，隨著體積分數的不斷增加，總黃酮提取量逐漸升高，總黃酮提取量在乙醇體積分數為80%時達到峰值；而后隨著乙醇體積分數進一步增加，總黃酮提取量開始呈下降趨勢。原因可能是隨著乙醇體積分數的逐漸增加，極性減小，溶液中其他親脂性物質等雜質溶出率也隨之增大，黃酮類物質競爭性結合乙醇-水分，從而影響了總黃酮的溶出[10]。綜合考慮，工藝優化試驗中乙醇體積分數參數采用70%、80%、90%作為響應面分析中該因素的3個水平。

圖2 乙醇體積分數對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

不同液料比對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響結果見圖3。

圖3 液料比對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of total flavonoids in the fruit bodies of Dictyophora indusiata cultivated under Phyllostachys edulis forest

由圖3可知，在其他因素不變的條件下，液料比在20∶1~30∶1，隨著比例的不斷升高，總黃酮提取量逐漸增大；當液料比達到30∶1后，隨著液料比的進一步升高，總黃酮提取量變化較小。綜合提取提取量、提取溶劑成本等因素考慮，為減少過濾時間及溶劑浪費，工藝優化試驗中液料比參數采用25∶1、30∶1、35∶1作為響應面分析中該因素的3個水平。

2.1.2 響應面設計試驗結果及分析

1）響應面試驗結果

根據試驗設計方案，選擇提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）、液料比（C）作為自變量，以毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量作為響應值設計響應面試驗，結果見表2。

表2 響應面試驗結果Tab.2 Results of response surface methodology

對表2試驗數據進行分析，使用Design Expert 8.05軟件得到總黃酮提取量與乙醇體積分數、提取溫度和液料比各因子的多元二次回歸方程，進而獲得以總黃酮提取量為指標的二次多項回歸模型為：

該回歸方程的相關系數R2為0.959 8。

對上述方程進行方差分析，結果見表3。

從表3結果分析可知，回歸方程中以總黃酮提取量為目標函數，其回歸效果均達到極顯著水平（P＜0.01）；模型決定系數R2的數值為0.959 8，結果可說明該模型能較好地與實際試驗相擬合；校正決定系數R2adj的數值為0.936 5，結果證明該模型能說明93.65%響應值的變化；失擬項中P值為0.888 6，P值大于0.050 0說明模型的失擬項不顯著；依照顯著性分析結果，提取溫度（A）、乙醇體積分數（B）對響應值影響顯著（P＜0.05），總黃酮提取量受AA、BB、CC以及AC的交互項影響顯著（P＜0.05）。影響總黃酮提取量因素的大小順序依次為：提取溫度（A）＞乙醇體積分數（B）＞液料比（C）。

表3 試驗結果方差分析Tab.3 Analysis of variance of experimental results

2）響應曲面圖結果與分析

依據擬合的響應曲面形狀，探討提取溫度、液料比及乙醇體積分數對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量的影響。將提取溫度、液料比及乙醇體積分數分別以0水平固定在模型中，從而獲得另外2個因素的交互影響結果[11]。二次回歸方程的響應面及其等高線見圖4～圖6。

由圖4～圖6可知，提取溫度（A）是對毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮提取量影響最顯著的因素，極值條件在等高線的圓心處，體現在響應面有較大的弧度變化，其次是乙醇體積分數（B）。液料比（C）響應面變化弧度迂緩，說明其影響響應值的效果不明顯。交互效應的強弱可利用等高線的形狀來反映，如二因素交互作用顯著，則呈橢圓形，反之則為圓形。因此，提取溫度（A）與液料比（C）之間對總黃酮提取量的交互作用影響比較明顯。

圖4 提取溫度和乙醇體積分數對總黃酮提取量的交互影響Fig.4 Interaction of extraction temperature and ethanol concentration on the yield of total flavonoids

圖6 提取溫度和液料比對總黃酮提取量的交互作用Fig.6 Interaction effect of extraction temperature and liquidsolid ratio on the yield of total flavonoids

圖5 乙醇體積分數和液料比對總黃酮提取量的交互作用Fig.5 Interaction effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.3 驗證試驗

采用Design-Expert 8.05軟件進行分析，利用Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程，可獲得其最佳提取條件：提取溫度為74.5℃，乙醇體積分數為76.1%，液料比為31.1∶1，理論上總黃酮提取量可達43.61 mg·g-1。

根據最佳提取條件進行3次平行試驗，測得總黃 酮 提 取 量 分 別 為42.78 mg·g-1、42.83 mg·g-1、42.76 mg·g-1。總黃酮提取量的實際平均值可達42.79 mg·g-1，是回歸模型預測理論值的98.12%，這一結果說明試驗結果與模型預測值擬合較好。

3 結論

通過毛竹林下仿野生生態栽培的竹蓀，其品質與野生竹蓀相近。目前傳統的毛竹經營效益不佳，林農生產經營毛竹的積極性不大。通過毛竹生產與林下竹蓀栽培相結合，可以最大程度提高毛竹林下的生產潛力，增加林農的經濟收入，促進鄉村振興。采用總黃酮提取量作為考察指標，Box-Behnken響應面法分析提取溫度、乙醇體積分數、液料比3個因素的影響，擬合出二項式數學模型，方差分析表明，提取溫度、乙醇體積分數對總黃酮提取結果影響顯著。對工藝條件進行優化和預測，在優化的工藝條件下，平行重復試驗3次，得到的真實值與預測值基本吻合。通過響應面試驗設計，優化得出毛竹林下栽培竹蓀子實體總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取溫度74.5℃，液料比31.1∶1，乙醇體積分數76.1%，該條件下總黃酮提取量為42.79 mg·g-1。該工藝為毛竹林下栽培的竹蓀中活性物質的提取及精深加工提供依據。