靈芝孢子粉加工工藝研究進展*

羌校君，胡 丹，黃甜甜，包振偉，張晨菊，徐春花，陳李華，陳 惠，吳偉杰

（江蘇安惠藥用真菌科學研究所有限公司，農業農村部食用菌加工重點實驗室，江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通 226000）

靈芝（Ganoderma lucidum）為多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（Ganoderma）的藥食兩用真菌，是我國收錄入藥典的傳統珍貴藥材。靈芝孢子是靈芝的生殖細胞，所含的有效活性成分包括多糖類化合物、三萜類化合物、不飽和脂肪酸、糖肽、蛋白質、腺苷等[1]；其中，靈芝酸主要包括靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C等[2]。現代藥理研究表明，靈芝孢子粉具有抗氧化、調節免疫、改善神經系統、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒等藥理作用[3]。

1 靈芝孢子破壁技術

1.1 靈芝孢子破壁的意義

在高倍顯微鏡下觀察，靈芝孢子呈卵形至卵圓形，孢壁雙層，外壁平滑，無色透明；內壁呈紅褐色，有小棘突[4]。深入研究發現，靈芝孢子細胞壁質堅性穩，不易酶解，直接服用后其有效成分難以被吸收利用[5]。黃曉蘭等[6]的研究結果表明，靈芝孢子粉破壁后獲得的多糖含量是破壁前的1.7倍。另有研究發現，未破壁的靈芝孢子粉總三萜平均含量為2.32%，而破壁后平均含量達4.22%[7]。破壁靈芝孢子粉的吸收率和免疫活性均顯著提高[8-9]。與靈芝子實體相比，靈芝孢子粉破壁后更易吸收，藥用功能也顯著增長[10]。

近50年來，對靈芝孢子粉的破壁工藝和技術進行了不斷完善[11]，目前已知的破壁方法有5大類，即化學法、生物法、物理法、機械法和綜合法。

1.2 化學法

利用食用酸或堿等化學試劑降解靈芝孢子壁，溶出并浸提得到功效成分[9]。化學法破壁能耗低，設備投入少，但存在浸提或破壁時間較長、易造成溶劑殘留等問題。因此，化學法多用于破壁前處理，或與其他方法結合使用。

1.3 生物法

1.3.1 萌發破壁法

人工調控誘導靈芝孢子自行萌發破壁，所需條件包括溫度、濕度、酸堿度、通氧量、光照量等[12]。研究表明，在pH 5、供氧、黑暗、28℃下培養48 h，新鮮的靈芝孢子萌發率可達70%[13]。劉昕等[14]研究發現，靈芝孢子萌發后抗癌活性顯著提高。不同靈芝品種間的孢子形狀與構造不盡相同，Leslie[15]指出靈芝孢子的雙層厚壁結構會阻礙其萌發。需說明的是，萌發破壁法主要是借助孢子自身的能量達到破壁的目的，因此利用該法破壁的孢子必須新鮮、飽滿、具有活力，而干癟、老化的靈芝孢子不易萌發，不宜使用此法。

1.3.2 酶解破壁法

利用溶壁酶在一定條件下處理靈芝孢子粉以達到破壁的目的[16]。酶解破壁法一般情況下條件溫和、可控，通常混合使用2種以上的溶壁酶。李國平[17]采用復合酶技術，添加多酶氧化酶、漆酶、纖維素酶，對細胞壁進行酶解的效果明顯。楊國光[18]發現生物酶解破壁的靈芝孢子粉具有顯著的增強免疫的作用。

1.3.3 溶菌法

利用溶壁菌等微生物對靈芝孢子粉進行破壁，發酵產生的蛋白酶等具有協同強化功效的作用。吳學謙等[19]利用可分泌幾丁質酶的蛹蟲草作為溶壁菌進行固體發酵，可達到靈芝孢子破壁的效果。

1.4 物理法

1.4.1 超聲波破壁法

將一定頻率和功率的超聲波作用于靈芝孢子粉，使之激發劇烈振動而開裂、破壁[20]。該方法一般不單獨使用，而是結合其他破壁方法一起使用以提升破壁效率。吳映明等[21]報道，超聲波結合超低溫凍融法破壁靈芝孢子粉，可提高其多糖提取率。

1.4.2 微波破壁法

借助微波輻射產生的高頻磁場，靈芝孢子內部介質會產生大量熱能，使細胞壁破裂[22]。此方法簡單方便，成本低，無污染。但是微波破壁易導致靈芝孢子內部的熱敏性功效物質變性或失活[23]。因此有研究人員使用微波處理結合低溫深加工技術進行破壁處理，其破壁率可達99%以上[24]。

1.4.3 超低溫冷凍破壁法

利用液氮等介質超低溫凍結靈芝孢子，解凍產生沖擊熱應力使孢子壁斷裂，從而實現破壁，使多糖等成分更易析出[20]。周順華等[5]利用過冷液氮對靈芝孢子進行淬冷破壁，顯示破壁率與凍結和解凍的循環次數呈正比。該方法破壁效果較好，操作簡便。

1.4.4 超臨界二氧化碳破壁法

以一定的溫度與壓力條件使二氧化碳變成液態介質，將超臨界流體滲入靈芝孢子，當細胞內外壓力達到平衡后突然降壓，導致靈芝孢子劇烈膨脹而破裂[25]。超臨界二氧化碳破壁法使用時溫度低，時間短，效率高，活性成分可完全保存。Fu等[26]通過超臨界二氧化碳破壁法提取靈芝孢子粉多糖，壓力為35 MPa，溫度為25℃，時間為4 h，二氧化碳流量為10 kg·h-1，在此破壁條件下靈芝孢子多糖提取率達2.98%，是未破壁的3倍。

1.5 機械法

1.5.1 機械超微粉碎研磨法

借助機械研磨介質產生的剪切、撞擊、擠壓及研磨作用，靈芝孢子間及與機械間發生碰撞和摩擦，從而實現破壁[27]。目前的超微粉碎技術分為干法和濕法，常用的有球磨式干法超微粉碎、濕法高速剪切、高壓均質破壁等[28]。杜樂樂[9]采用超微粉碎法獲得破壁靈芝孢子粉的免疫活性顯著增強。

1.5.2 氣流式超微粉碎破壁法

高壓氣流通過噴嘴噴出，其迅速膨脹產生超音速高湍流氣流作為顆粒的載體，利用孢子之間或孢子與固定板之間產生的沖擊性擠壓、磨擦和剪切等作用，達到破壁[29]。肖鑫等[30]先以纖維素酶預處理靈芝孢子，再用氣流式超微粉碎破壁法進行粉碎，其破壁率可達99%以上。崔寧[31]等用超臨界二氧化碳流體超高壓對靈芝孢子粉撞擊，破壁效果良好。葉坤等[32]用真空低溫微波脆化靈芝孢子壁，再進行氣流粉碎30 min，破壁率達99%。

1.5.3 擠壓膨化破壁法

通過對設備腔體加熱，螺桿旋轉對靈芝孢子進行擠壓和剪切，使其因受熱、高壓及剪切等作用發生細胞壁破裂[33]。焦艷麗等[34]研究發現，靈芝孢子粉擠壓膨化2次后，破壁率達83.48%，多糖得率為2.37%。

1.5.4 高壓均質破壁法

利用柱塞泵對靈芝孢子粉加壓，一定的壓力下使其通過一個狹窄的間隙進行破壁，且分散的靈芝孢子粉又可在破壁后均勻混和[35]。劉春延等[36]采用高壓均質法破壁靈芝孢子，以水為溶劑，均質壓力為150 MPa，均質次數為3次，料液比為1∶100，此時破壁率達94.35%，且具有較好的抗腫瘤活性。

1.5.5 髙壓脈沖電場破壁法

利用電穿孔原理，短時間內對靈芝孢子壁造成破壞，實現破壁[37]。劉俊麗等[38]研究結果表明，高壓脈沖電場破壁靈芝孢子的最佳工藝參數為:脈沖寬度80μs，脈沖個數40 000個，電場強度25 kV·cm-1；該條件下孢子破壁率為（66.74±0.03）%，多糖溶出量為（0.99±0.11）g·100-1g-1，總三萜溶出量為（1.79±0.03）g·100-1g-1。

1.6 綜合法

在靈芝孢子工業化精深加工過程中，通常根據實際情況采用多種方法結合進行破壁，既可提高生產效率，又能優化工藝效果。常用的組合破壁方法有機械與物理方法綜合、機械與生物或化學方法疊加等。李淑芳等[39]綜合運用萌發、超微粉碎和酶解法進行破壁，破壁率達85.38%；同時，此方法可用于靈芝孢子油提取的前處理。齊慧等[40]發現，γ射線輻照與球磨技術結合處理靈芝孢子粉的破壁率達97.18%。周萍等[41]將變溫壓差脆化與超微粉碎技術結合，使破壁率提高至99.5%。

多種技術的引入和結合，拓展了靈芝孢子粉破壁技術的研究應用方向，開啟了極大的創新空間。Wang等[42]結合超聲波和低溫冷凍等技術，采用乙醇等化學試劑，協同化學反應和物理驅動，加深和擴大靈芝孢子表面淺孔，導致孢子壁變脆弱；再使用β-環糊精密封破損小孔，使孢子表面由疏水性變為親水性，促進靈芝孢子活性成分的消化和吸收；檢測三萜類化合物的溶出量、評估生物活性成分的釋放效率；結果表明該方法是制備高活性、穩定性靈芝破壁孢子粉產品的有效途徑。

2 靈芝孢子粉提取的技術研究

2.1 靈芝孢子活性成分的提取

2.1.1 靈芝孢子粉的熱水提取技術

靈芝孢子粉的水提物以多糖為主，也含有少量的三萜與甾醇。靈芝孢子多糖從一級結構來看主要是雜多糖，但多糖的成份與破壁與否無關[43]。王會賓等[44]探究多因素對靈芝孢子多糖熱水提取率的影響，其中提取溫度的影響最大，其次為提取時間和液料比。黃璞[45]采用水浸法結合冷凍干燥等技術，靈芝孢子多糖提取率提高30%。研究表明，靈芝孢子多糖能顯著抑制腫瘤、提升機體免疫功能，在進行預防和治療相關疾病藥物的開發方面具有較好的前景[46]。

2.1.2 靈芝孢子的醇提取技術

靈芝三萜類化合物在水中的溶解度極低，卻易溶于氯仿、甲醇等有機溶劑。針對此特點，先用甲醇或乙醇提取破壁靈芝孢子粉，形成濃縮液，再用乙酸乙酯萃取分出總酸，進行分離，通過干燥層析后獲得目標物。沈建英等[47]用95%乙醇回流提取破壁靈芝孢子，再經乙酸乙酯萃取，得到的提取物主要成分即為三萜類化合物。溫慧萍等[48]發現，采用體積分數為80%的乙醇溶液提取的靈芝孢子粉總三萜，具有較好的抗氧化能力，對人肝癌細胞HepG-2具有一定的抑制作用。

另外，水提醇沉法是靈芝孢子多糖的常見提取方法。為提高靈芝孢子多糖提取率，通常會在水提醇沉的基礎上增加超聲波、微波、粉碎、酶解等工藝技術。張玲瑜等[49]得到超聲波輔助提取多糖最佳工藝參數，料液比為1∶20，提取溫度為35℃，提取時間為1.5 h，提取功率為450 W，此時靈芝孢子粉多糖提取率為4.99%。

2.1.3 靈芝孢子的酶提取技術

運用各種能徹底分解靈芝孢子細胞壁的酶（蛋白酶、纖維素酶等），加入破壁后的靈芝孢子粉混懸液中，提高孢子中的多糖和三萜等有效成分的溶出率。此法多在靈芝孢子破壁時采用，或結合使用。運用中性蛋白酶酶解破壁靈芝孢子粉，最佳酶解反應條件為：酶用量為2 000 IU·g-1、pH 7.5、酶解溫度為60℃、酶解時間為1 h，油脂提取率為88.71%[50]。

2.2 靈芝孢子油的提取

靈芝孢子油是從靈芝孢子中萃取得到的油狀脂質物，約占靈芝孢子質量的20%[51]。孢子油中有效活性物質以靈芝三萜類化合物為主[52]。直接食用靈芝孢子油能發揮免疫調節、提高機體耐缺氧能力、降低血脂、神經調節和抗腫瘤等良好的保健功效，因此在保健品和醫藥領域的市場應用前景廣闊。早期，提取靈芝孢子油主要采用溶劑浸提法，雖然提取率高，簡單易操作，但存在溶劑殘留問題，不利于進一步純化。后來在溶劑浸提法的基礎上，結合超聲波、微波、破碎等技術，進一步提高了靈芝孢子油提取率。目前，國內對于靈芝孢子油提取分離的方法主要有索氏提取法、超臨界二氧化碳萃取法和水酶法等。

2.2.1 索氏提取法

在特定燒焙的容器中不斷加入溶劑，經過多次虹吸回流后使之完全萃取。索氏提取法具有萃取效率高的特點。楊文婧等[53]試驗結果顯示，與超臨界二氧化碳萃取法、水酶法相比，索氏抽提法的提油率最高，提取的靈芝孢子油中三萜類物質的含量約達24.45%。

2.2.2 超臨界二氧化碳萃取法

超臨界二氧化碳萃取（SFE-CO2）是一種高新分離技術，也是工業制備獲取靈芝孢子油的常用分離方法。與傳統脂溶性化合物提取技術相比，該法在常溫下進行萃取，無溶劑殘留，條件溫和，可循環利用，成本低，純度高，工藝流程簡單，技術方法安全，且有助于易揮發性產品的保存，可以保證孢子油的品質[54]。

高宇杰等[55]在萃取壓力為30 MPa、萃取溫度為40℃、分離釜Ⅰ壓力為8 MPa、分離釜Ⅰ溫度為56℃的條件下進行萃取，靈芝孢子油的得率為29.45%。Li等[56]在此基礎上進行條件優化，當壓力為35 MPa、時間為3 h、溫度為48℃時，得率提升至29.50%，顯著高于超聲提取法（23.74%），與索氏提取法（30.02%）相比無顯著差異。這些研究都為靈芝孢子油的提取、鑒定及應用提供了一定的理論依據。

2.2.3 水酶法

以機械破碎為基礎，利用水解酶對靈芝孢子細胞結構以及脂蛋白、脂多糖等成分進行分解，使孢子油更容易游離、流動并析出[57]。作為一種新興的油品提取技術，水酶法工藝更為簡單，對設備的要求更低，提取的油脂品質更好[58]。

3 靈芝孢子類產品的制備與選用

近年來，隨著靈芝規模化栽培、深加工技術精進、產業化發展的持續進步，靈芝孢子粉的產量顯著增加，產品也日漸豐富。查詢相關文獻及國家食品藥品監督管理局官方網站，目前以靈芝孢子粉為原料的藥品以單方為主；其他劑型包括復方膠囊、破壁粉膠囊、孢子粉咀嚼片、孢子精油軟膠囊等，多作為保健品；功能和療效主要涉及降血糖、降血脂、調節免疫等方面[59]。

3.1 單方靈芝孢子粉

靈芝孢子粉單方產品主要有破壁和未破壁2種，其包裝形式多為袋裝或者膠囊劑。目前破壁靈芝孢子粉標準體系尚不完善，僅有團體標準[60-63]，無國家標準，且各地標準的參數設置相差較大。在靈芝孢子粉的檢測指標中，破壁率、活性成分以及安全性是其產品的主要檢驗項目。Chen等[64]發現傅里葉變換紅外顯微光譜（FTIR）技術是一種簡單有效的鑒別靈芝孢子破壁與否的方法。姚仲青等[65]對靈芝孢子粉的破壁率、含油量、多糖含量、總三萜含量進行了較全面的研究，以期建立靈芝孢子粉的質量標準。

3.2 靈芝孢子粉合劑

將破壁靈芝孢子粉與靈芝提取物等其他不同的原料進行組合，制成沖劑、顆粒劑、咀嚼片劑等復方靈芝孢子粉制劑。王建明等[66]使用靈芝孢子粉與知母、百合、麥冬等復方制成降糖膠囊劑，可降低血糖、血脂，增強體力和免疫力，對Ⅱ型糖尿病患者有較好的治療作用。

3.3 靈芝孢子油軟膠囊

將靈芝孢子油經軟膠囊注封工藝，可與番茄紅素、花青素等抗氧化劑制成合劑膠囊。目前市場上靈芝孢子油多為透明的軟膠囊制劑，通常以顏色和氣味評價產品質量；透明度越高說明雜質含量越少，香氣的純度越髙，品質越好，而劣者相反[67]。靈芝孢子油價格較昂貴，但因與植物油外觀相近，市售產品中摻加植物油或以植物油假冒靈芝孢子油的現象時有發生。因此，有研究人員采用高效液相色譜法（HPLC）建立了靈芝孢子油指紋圖譜，可快速鑒別真品與混淆品[68]。

3.4 靈芝孢子油的微囊技術

微囊化技術是保護不飽和脂肪酸免于氧化降解的有效手段，可用于靈芝孢子油產品的生產和貯存，可以保證其品質。李芳等[69]以阿拉伯膠、明膠為囊材制備孢子油產品，微囊包埋率達94.32%。Zhou等[70]研究噴霧干燥法制備靈芝孢子油微囊的方法，結果表明囊材選擇為阿拉伯樹膠和麥芽糊精時，靈芝孢子油的氧化穩定性顯著提高，多不飽和脂肪酸含量達80.04%。

4 討論與展望

近年來，靈芝人工栽培規模、精深加工技術、產品制備工藝日趨成熟，相關研究不斷深入，產業發展不斷深化，較好地滿足了民眾對靈芝孢子粉類產品的需求。目前在國內市場上流行的靈芝類產品中，破壁靈芝孢子粉仍占據主要地位，達到靈芝類產品的40%[71]。

在實際的工業化生產中，靈芝孢子粉的破壁大多綜合運用機械法和物理法，靈芝孢子油的提取則通常使用超臨界二氧化碳萃取法。在對靈芝孢子進行破壁、提取、加工等產品制備的過程中，保持其有效成分的活性尤為重要，其關鍵點是預防和減少內含物質的氧化。

破壁靈芝孢子粉的質量評價需要制定推薦性或強制性國家標準，這是推動產業發展的重要課題。同時，一些新興技術的發展和普及，對靈芝孢子粉的鑒定識別、活性物質含量測定、安全性評估、新品研發等帶來了新的思路，展現出旺盛的創新活力。