降溫刺激下雙孢蘑菇胞外酶活性、多糖含量及單糖組成的變化規律*

應學兵，陸 娜，林佳瑤

（1.杭州市臨安區農林技術推廣中心，浙江 杭州 311300；2.杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）在分類上屬于真菌門（Fungi）擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇屬（Agaricus）[1]，是世界上栽培最廣泛、消費量最高的食用菌之一[2]。雙孢蘑菇屬于穩溫結實性的菌類，在工廠化栽培的過程中，其菌絲從營養生長轉向生殖生長需要進行降溫刺激[3]，即在覆土、搔菌結束后的催蕾期，將環境溫度從21.5℃勻速降至17.5℃[4]。在自然界中，于較冷的秋季形成子實體的野生蘑菇，采取降溫處理的目的，即以工廠化生產環境控制關鍵裝備模擬自夏季到秋季的氣候轉變過程[5]。其次，雙孢蘑菇是對溫度非常敏感的真菌，0.5℃的溫度差異就會對其生長速度、品質和產量產生巨大的影響[4]。因此在催蕾出菇的關鍵階段，精確降溫期的時長是提高其生產效率的重要因素。

雙孢蘑菇的生長主要依靠木質素、纖維素、半纖維素及淀粉等大分子營養物質，需要將大分子碳水化合物、蛋白質等物質分解為小分子營養物質，進行吸收和轉化，此過程與菌絲分泌的胞外酶活性緊密相關[6]，直接決定了子實體的產量和品質[7]。糖類是生物體內除蛋白質和核酸以外的另一類重要生物大分子[8]。雙孢蘑菇多糖具有調節免疫[9]、抗氧化[10-11]、防止食品腐敗[12]、促動物運動損傷修復[13-14]等活性。研究發現，降溫刺激條件的改變可影響營養菌絲和子實體細胞壁的可溶性多糖含量，而多糖中單糖的比例不同，細胞壁的糖苷鍵和多糖構象也不同[15]。因此胞外酶種類和活性的差異、可溶性多糖含量及多糖中單糖比例情況可以作為衡量和決定降溫刺激強度的指標[16]。

通過以漆酶、半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶的活性，可溶性多糖含量，以及單糖結構為測定指標，在雙孢蘑菇催蕾期分別在4 d、6 d、8 d三個不同時間段內進行21.5℃到17.5℃的勻速降溫處理。對其營養生理條件進行動態分析研究，掌握環境因素對其菌絲體及子實體生長的影響，從而探索雙孢蘑菇菌絲從營養生長轉化到子實體發生發育的過程中，內在的生長發育機制。同時，結合蘑菇產量指標確定最佳降溫刺激強度，進一步完善雙孢蘑菇催蕾技術，促進產業健康發展。

1 材料與方法

1.1 雙孢蘑菇催蕾期不同降溫時長的處理

雙孢蘑菇栽培品種為W192。

培養料配方為麥草53%、雞糞40%、石膏4.4%、花生粕2.5%、尿素0.1%，浙江省嘉善寧遠農業開發有限公司。

覆土材料為純草炭土。

培養料處理方法一致，選取堆料、發酵、上架及播種時間一致的出菇房開展試驗。在催蕾過程中，選取3間出菇房分別在4 d、6 d、8 d三個不同時間段內將培養溫度從21.5℃勻速降至17.5℃，二氧化碳及濕度管理保持一致。

1.2 樣品采集

分2個時期采收樣品。接種后進行降溫催蕾的時期記為第Ⅰ期；第一潮菇采收后進行養菌，再次降溫催蕾的時期記為第Ⅱ期。隨機選取不同高度的菇架，每層取3個點的樣品，共取約200 g，將所有樣品均勻混合后從中取50 g，每個處理設置3次重復。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 試劑材料

氯仿，南京化學試劑有限公司；疊氮化鈉，杭州藍博實業有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸、磷酸二氫鉀、氯化鈉、無水乙醇、正丁醇、氫氧化鈉，成都市科龍化工試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、硼氫化、鈉鹽酸、無水磷酸氫二鈉、D-葡萄糖，成都市科龍化工試劑廠；D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-核糖苯酚、果膠酶，阿拉丁科研試劑公司；0.4 nm分子篩，浙江富陽市杭富生物制品廠；濃硫酸，浙江省蘭溪市靈洞鄉；二甲基亞砜（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；木瓜蛋白酶、牛肉血清蛋白，西格瑪化工試劑有限公司。

1.3.2 試驗儀器

HH-2K4恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司；-50℃真空冷凍干燥機，拉博科科技有限公司；ZHWY-211B恒溫振蕩培養器，上海智城分析儀器制造有限公司；CL31R多功能高速離心機、APS-2 HYPERSIL色譜柱（5μm，4.0 mm×250 mm）、LCQ DECA XP MAX質譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；R-501旋轉蒸發儀，上海科學儀器有限公司；Sartorius BSA224S電子分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；CL-100雙層圓盤電爐，浙江嘉興市楓橋電熱器廠；JK-2200DB數控超聲波清洗器，合肥金尼克機械制造有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow纖維素填料，英國沃特曼試劑公司；離子交換層析柱（1.6 cm×10 cm）、Sephacryl S-100凝膠柱（16/60）、AKTA Purifier100層析純化儀，美國通用電氣公司；U-1900可見分光光度計，日立中國有限公司；SEC色譜柱、Shodex OHpak SB-G保護柱（SB 803），昭和電工科學儀器（上海）有限公司；5980型GC-MC氣相色譜，安捷倫科技公司；2300多功能酶標儀，珀金埃爾默儀器有限公司；SC-360Y立式透明冷藏箱，青島澳柯瑪股份有限公司。

1.4 胞外酶活性測定方法

1.4.1 樣品制備

不同時期的菌絲體樣品分別制備發酵液，經2層紗布抽濾后收集發酵液。于4℃、12 000 r·min-1冷凍離心20 min，上清液即為粗酶液，用于胞外酶活性測定，保存備用。

1.4.2 羧甲基纖維素酶活力的測定

取0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5 mL，加入粗酶液0.5 mL，混勻，50℃恒溫水浴30 min；取出后立即加入DNS試劑1.5 mL，煮沸5 min；取出，冷卻后加蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。分光光度計波長540 nm處測吸光度值，以經煮沸滅活的粗酶液為對照，以蒸餾水為空白對照，每組測定3次，取平均值。酶活力單位定義：1 mL培養液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為一個活力單位。

葡萄糖標準曲線：精密移取1 mg·mL-1的葡萄糖標準液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL于試管中，分別補蒸餾水至2.0 mL。混勻后加入DNS試劑1.5 mL，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫后加入蒸餾水定容至20 mL。以蒸餾水為空白對照，于540 nm處測定吸光度值，每組測定3次，取平均值。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制得到標準曲線回歸方程。

1.4.3 半纖維素酶活力的測定

0.5%木聚糖溶液1.5 mL，加入粗酶液0.5 mL，混勻，50℃水浴1 h，之后操作與1.4.2羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 mL培養液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg木糖為一個活力單位。

木糖標準曲線：使用1 mg·mL-1的木糖標準液，其余過程與1.4.2葡萄糖測定過程相同。以木糖質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，給制得到標準曲線回歸方程。

1.4.4 漆酶活力的測定

往試管中加入5 mmol·L-1鄰聯甲苯胺溶液（用pH 4.6、0.1 mol·L-1的醋酸鹽緩沖液配制）1.9 mL，加入粗酶液0.1 mL，混勻，28℃恒溫水浴30 min；取出后于分光光度計波長600 nm處檢測吸光度值。對照為經煮沸滅活的粗酶液0.1 mL。酶活力單位定義：1 mL培養液中的酶與底物作用30 min，每分鐘吸光度值改變0.01為一個活力單位。

1.4.5 蛋白酶活力的測定

10 mL離心管中加入1 mL稀釋粗酶液（使其測定的吸光度值在0.2~0.4為宜），40℃水浴3 min~5 min；加入2%酪蛋白溶液1 mL，40℃保溫準確計時10 min，立即加入0.4 mol·L-1的三氯乙酸2 mL；于40℃水浴15 min后8 000 r·min-1離心1 min；取1 mL上清液，加入0.4 mol·L-1的碳酸鈉溶液5 mL，加入福林-酚試劑1 mL，搖勻，40℃水浴顯色20 min。空白試管中先加入0.4 mol·L-1的三氯乙酸2 mL，再加入2%酪蛋白溶液1 mL，40℃水浴15 min后離心，后續操作與試驗管相同。酶活力單位定義：1 mL培養液中的酶催化酷蛋白每分鐘產生1μg酪氨酸定義為1個活力單位。

酪氨酸標準曲線：精密移取100μg·mL-1的酪氨酸標準液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL于試管中，分別補蒸餾水至10 mL。混勻后取1 mL，加入0.4 mol·L-1碳酸鈉溶液5 mL，福林-酚試劑1 mL，搖勻，40℃水浴顯色20 min，波長為680 nm處檢測吸光度值。以酪氨酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制得到標準曲線回歸方程。1.4.6 淀粉酶活力的測定

往試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液（用pH 5.8、0.1 mol·L-1的醋酸鹽緩沖液配制）1.5 mL，加粗酶液0.5 mL，混勻，38℃恒溫水浴30 min，之后操作與1.4.2羧甲基纖維素酶活性測定相同。酶活力單位定義：1 mL培養液中的酶與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為一個活力單位。使用葡萄糖標準曲線，繪制方法同1.4.2。

1.5 多糖含量測定方法

1.5.1 雙孢蘑菇菌絲前處理

將菌絲去除泥土等雜質，水洗后置于50℃真空恒溫干燥箱中烘干，直至2次稱重質量基本不變。取出后放入粉碎機粉碎，備用。

1.5.2 雙孢蘑菇菌絲多糖的制備

稱取一定量的菌絲粉末，設置3個平行樣，按料液比為1∶40加入蒸餾水，95℃水浴提取3 h，保持低速攪拌。提取完成后進行抽濾，利用旋轉蒸發儀55℃、40 r·min-1減壓濃縮，濃縮至1/3體積后，加入4倍體積的95%乙醇，醇沉2 h。4 000 r·min-1離心后棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗滌2次后用水復溶，凍干保存。將樣品溶解于蒸餾水中配制成2%的溶液，用木瓜蛋白酶在pH 6.0、50℃、酶質量分數為2%（與樣品的質量相比）的條件下進行酶解蛋白反應2 h，每隔半小時進行攪拌。然后升溫至55℃反應1 h，反應結束后90℃水浴滅活10 min；6 000 r·min-1離心10 min，取上清液；然后加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿與正丁醇的體積比為3∶1）進行脫蛋白。在不濺出容器的前提下以最大速度充分振蕩1 h。6 000 r·min-1離心10 min，取上清液繼續進行脫蛋白操作，重復脫蛋白操作直至無明顯的白色沉淀產生。將上述溶液在55℃條件下減壓濃縮除去殘留有機溶劑，濃縮至200 mL以下，裝入透析袋（3 500 Da），蒸餾水透析3天后凍干，得到白色絮狀物，即粗多糖[17]。

1.5.3 多糖含量的測定

雙孢蘑菇多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，即多糖在濃硫酸作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成一種橙黃色化合物。在10 mg~100 mg，其顏色深淺與多糖含量成正比，且在490 nm波長下有最大吸收峰，通過測定和計算得到樣品多糖含量。具體方法如下。

1）標準曲線繪制

準確吸取葡萄糖標準液0、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，分別加水至2.0 mL，漩渦混勻器混勻；加入6%苯酚0.1 mL，用漩渦混勻器混勻；再加5 mL濃硫酸，迅速混勻；室溫放置5 min，然后在沸水浴中保溫15 min；用自來水冷卻5 min，再用漩渦混勻器混勻，于490 nm測吸光度值。以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白對照。以吸光度值為橫坐標，以葡萄糖標準溶液體積為縱坐標繪制標準曲線。

2）樣品測定

吸取樣品1.0 mL（V3），加水補充至2 mL，漩渦混勻器混勻后加入6%苯酚0.1 mL，再混勻；加入濃硫酸5 mL，迅速混勻。室溫放置5 min，然后在沸水浴中保溫15 min，用自來水冷卻5 min，再用漩渦混勻器混勻，于波長490 nm處測定吸光度值。根據吸光度值在標準曲線上讀取葡萄糖標準溶液的體積（V4）。

3）多糖的含量

多糖含量（w，g·100-1g-1）的計算公式為：

式中：C為葡萄糖標準溶液的質量濃度（μg·mL-1）；V1為樣品提取時定容的體積（mL）；V2為樣品醇沉物溶解時定容的體積（mL）；V3為取樣的被測樣品的體積（mL），即1 mL；V4為從標準曲線上讀取的葡萄糖標準溶液的體積（mL）；m為稱取的樣品質量（g）；0.9為葡萄糖和多糖的轉換單位系數。

1.6 單糖組成測定方法

采用氣相色譜（GC）法進行多糖中單糖組分的分析和鑒定，標準對照品有D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖。

1.6.1 標準對照品制備

分別精密稱取0.002 mol·L-1的鼠李糖（Rham）、巖藻糖（Fuc）、木糖（xyl）、阿拉伯糖（Ara）、核糖（Rib）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal），溶于30 mL蒸餾水；取3 mL溶液，加入硼氫化鈉30 mg，密塞，室溫下還原3 h；然后用冰醋酸中和過量的硼氫化鈉，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干；重復4次~5次，真空條件下以五氧化二磷干燥過夜。再加入醋酸酐4.0 mL，100℃反應1 h，然后加入甲苯3.0 mL，減壓蒸干。將乙酰化后的產物用氯仿溶解，轉移至分液漏斗；加入等體積的蒸餾水充分混勻，靜置分層；除去上層水溶液，重復3次~4次。氯仿層以適量無水硫酸鈉干燥、過濾，定容至10 mL，待GC-MS分析。

1.6.2 多糖樣品衍生化

稱取多糖樣品2.0 mg于薄壁長試管中，再加入2.0 mol·L-1三氟乙酸4.0 mL，封管，110℃水解2 h。水解后，低于40℃溫度下減壓蒸干，再加入甲醇蒸干，重復操作4次~5次，以完全除去三氟乙酸。

將完全酸水解的樣品溶于約3 mL的蒸餾水中，加入30 mg硼氫化鈉，密塞，于室溫下還原3 h；用冰醋酸中和過量的硼氫化鈉，加入少量甲醇，減壓濃縮蒸干；重復4次~5次，真空條件下用五氧化二磷干燥過夜。加入醋酐4 mL，100℃反應1 h；加入3 mL甲苯，減壓濃縮蒸干。將乙酰化產物用3 mL氯仿溶解，轉移至分液漏斗，加入等量的蒸餾水充分混勻，靜置后除去上層水溶液，重復3次~4次。氯仿層以適量的無水硫酸鈉干燥，用玻璃注射器吸取后經有機膜過濾，氯仿定容至10 mL，即得多糖水解物的乙酰化產物，待GC-MS分析。

1.6.3 GC-MS條件

HP-5毛細管柱（規格為30.00 m×0.32 mm×0.25μm），氫火焰離子化檢測器（FID），高純度氮氣為載氣。初始柱溫為120℃，以10℃·min-1升溫至240℃，恒溫6.5 min。進樣量為2.0μL，進樣口溫度為250℃，分流比為1∶50，檢測器溫度為250℃；氫氣流速35 mL·min-1，空氣流速350 mL·min-1，尾吹氣流速30 mL·min-1，柱內流速1.0 mL·min-1。

1.7 生長趨勢及產量記錄

隨機選取不同高度菇架的作為試驗區，每個試驗區面積為10 m2。觀察菌絲長勢，記錄產量，設置3個重復。

1.8 統計分析

試驗結果以平均值表示，采用Pearson相關性分析法分析酶活力與菌絲多糖之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 漆酶活性

漆酶是一種含有銅離子的多酚氧化酶，具有很強的木質素降解能力，其活性大小可以衡量菌株對木質素的降解能力[18-19]。因此，漆酶活性的變化與雙孢蘑菇菌絲利用木質素類物質的能力密切相關。探究降溫條件對漆酶活性的影響，結果見圖1。

圖1 不同降溫時長處理下雙孢蘑菇的漆酶活性Fig.1 Laccase activity of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖1所示，在第Ⅰ期，6 d降溫至17.5℃的處理下漆酶活性最高，為1.006 U；依次為6 d＞4 d＞8 d。在第Ⅱ期，降溫6 d處理下漆酶活性也是最高，為0.986 U；依次為6 d＞8 d＞4 d。綜合分析，6 d處理下的雙孢蘑菇菌絲體對木質素類物質的分解能力更強。

2.2 羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性

羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶均屬于降解酶類，與菌絲體對不同碳源的利用情況有關[20]。不同降溫時長對這3種酶的影響結果見圖2。

圖2 不同降溫時長處理下雙孢蘑菇的羧甲基纖維素酶(A)、半纖維素酶(B)、淀粉酶(C)活性Fig.2 Activities of carboxymethyl cellulase(A),hemicellulase(B)and amylase(C)of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖2所示，試驗結果表明雙孢蘑菇在第Ⅰ期及第Ⅱ期的降溫處理過程中，羧甲基纖維素酶、半纖維素酶及淀粉酶活力情況均不一致。羧甲基纖維素酶在8 d降溫處理下第Ⅰ期（3.630 U）和第Ⅱ期（3.721 U）的酶活力均達到最高值；依次為8 d＞6 d＞4 d。半纖維素酶的酶活力在第Ⅰ期降溫處理中，依次為6 d＞4 d＞8 d；第Ⅱ期降溫處理中，依次為4 d＞6 d＞8 d。淀粉酶的酶活力在第Ⅰ期降溫處理中，依次為4 d＞8 d＞6 d；第Ⅱ期降溫處理中，依次為8 d＞6 d＞4 d。綜合分析，3種處理下的羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶活性各具有優勢，能針對不同碳源進行吸收和利用。

2.3 蛋白酶活性

蛋白酶的作用主要是對肽鏈進行分解，使蛋白質降解成小的蛋白胨、小肽或氨基酸，為菌絲生長和子實體轉化提供有效氮源[21-22]。探究降溫條件對蛋白酶活性的影響，結果見圖3。

圖3 不同降溫時長處理下雙孢蘑菇的蛋白酶活性Fig.3 Protease activity of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

如圖3所示，不同降溫時長處理對第Ⅱ期的蛋白酶酶活性影響更大。在第Ⅰ期，8 d降溫處理酶活力達到最高值，為3.415 U，依次為8 d＞4 d＞6 d；在第Ⅱ期，4 d降溫處理后酶活力達到最高值，為3.800 U，依次為4 d＞8 d＞6 d。綜合分析，8 d和4 d降溫處理下蛋白酶活力較高，說明其降解蛋白質的能力較強，能獲得更多的氮源。

2.4 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖含量分析

探究不同降溫時長對雙孢蘑菇中多糖含量的影響，結果見圖4。

圖4 不同降溫時長處理下雙孢蘑菇中多糖的含量Fig.4 Polysaccharide content in Agaricus bisporus treated with different cooling duration

由圖4可知，在第Ⅰ期，4 d降溫處理下多糖含量最低，為1.68 g·100-1g-1，8 d降溫處理多糖含量最高，為2.20 g·100-1g-1。但進入第Ⅱ期，4 d處理下多糖含量最高，為3.30 g·100-1g-1，其次是6 d，為2.90 g·100-1g-1，8 d最低，僅有2.70 g·100-1g-1。綜合分析，在第1潮菇菌絲體生長階段，8 d處理下菌絲體多糖含量較高；在第2潮菇菌絲體生長階段，4 d處理下子實體多糖含量較高。

2.5 不同降溫處理對雙孢蘑菇菌絲長勢和產量的影響

對不同降溫處理下的雙孢蘑菇菌絲長勢進行觀察發現，4 d處理下的菌絲長速最快，從降溫開始至第7天即出現原基，第12天進入采收期；6 d處理下，從降溫開始至第9天出現原基，第13天進入采收期；8 d處理下，菌絲生長速度明顯下降，從降溫開始至第10天陸續出現原基，第15天進入采收期。

記錄不同降溫處理下雙孢蘑菇的產量，結果見表1。

如表1所示，比較不同的菇潮產量可知，3個處理下產量最高的均為第1潮菇，約占三潮菇總產量的50%；第2潮和第3潮菇的產量呈減少的趨勢。比較不同處理下的平均產量，4 d和6 d處理下方法的產量分別為26.39 kg·m-2和26.23 kg·m-2，4 d處理下產量略高，但二者無顯著性差異；8 d處理下產量顯著降低，為25.12 kg·m-2。

表1 不同降溫時長處理下雙孢蘑菇的產量Tab.1 Yield of Agaricus bisporus treated with different cooling duration

2.6 酶活力與多糖含量、產量的相關性

使用Pearson相關性分析法分析酶活力與菌絲多糖含量、產量之間的相關性，結果見表2。

如表2所示，雙孢蘑菇多糖含量與淀粉酶具有顯著負相關性，相關系數為-0.893；和蛋白酶表現為強正相關，相關系數為0.642；和其他胞外酶均為正相關。產量和羧甲基纖維素酶具有顯著負相關性，相關系數為-0.907；和半纖維素酶、漆酶均為正相關，相關系數分別為0.688、0.538。

表2 胞外酶活性與多糖含量、產量的相關性Tab.2 Correlation of extracellular enzyme activity with polysaccharide and yield

2.7 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖中的單糖組成分析

通過比較8種單糖標準品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時間，定性分析雙孢蘑菇菌絲多糖的單糖組成，結果見表3。第Ⅰ期不同降溫時長處理下的色譜圖見圖5~圖7，第Ⅱ期不同降溫時長處理下的色譜圖見圖8~圖10。

表3 雙孢蘑菇不同降溫處理下多糖中的單糖組成Tab.3 Monosaccharide composition of Agaricus bisporus polysaccharide under different cooling treatments

圖7 第Ⅰ期處理8天樣品的單糖組成色譜圖Fig.7 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for eight days at the stageⅠ

圖8 第Ⅱ期處理4天樣品的單糖組成色譜圖Fig.8 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for four days at the stageⅡ

如表3以及圖5~圖10所示，檢測樣品中均含有標準品中的8種單糖組分；單糖標準品按照保留時間的先后順序依次為鼠李糖（20.462 min）、巖藻糖（20.798 min）、核糖（21.583 min）、阿拉伯糖（21.855 min）、木糖（22.396 min）、甘露糖（32.103 min）、葡萄糖（32.923 min）、半乳糖（34.024 min）。分析雙孢蘑菇菌絲多糖中這8種單糖組分的含量，其摩爾比在各處理中各不相同。由此可知，雙孢蘑菇菌絲各階段的多糖組成不同，其中主要以葡萄糖、半乳糖和甘露糖為主。當雙孢蘑菇生長從降溫期到采收期，其多糖組成中的葡萄糖、半乳糖含量逐漸增加。

圖5 第Ⅰ期處理4天樣品的單糖組成色譜圖Fig.5 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for four days at the stageⅠ

圖10 第Ⅱ期處理8天樣品的單糖組成色譜圖Fig.10 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for eight days at the stageⅡ

圖6 第Ⅰ期處理6天樣品的單糖組成色譜圖Fig.6 Chromatogram of monosaccharide composition in samples treated for six days at the stageⅠ

3 討論

雙孢蘑菇生長過程中最重要的營養來源是碳源。除了少數的碳水化合物不能被利用以外，從單糖到纖維素、半纖維素、淀粉、木質素等各種復雜的碳水化合物都能作為碳源被利用。這些碳源主要參與細胞物質的構成，以及為其生長發育提供能量。但在生長過程中菌絲不能直接吸收利用這些長效碳，而必須先將大分子有機物分解成單糖、雙糖。因此雙孢蘑菇在生長過程中，菌絲能夠分泌的分解酶的種類和數量決定了可利用的糖的種類及利用率。所以，通過調控環境因子，誘導纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶等胞外酶的產生，可為特效碳的充分利用打好基礎。

通過研究發現，不同降溫時長處理下雙孢蘑菇在第Ⅰ期及第Ⅱ期都具有完整的胞外酶體系，但酶活指標并不相同。第Ⅱ期的羧甲基纖維素酶、半纖維素酶及蛋白酶活性高于第Ⅰ期，而漆酶、淀粉酶活性則低于第Ⅰ期。這與陳慶榆[23]的研究結果一致，在其研究中發現，羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活性峰值出現在子實體成熟期；淀粉酶和漆酶活性在菌絲生長期較高，并隨栽培時間的延長而下降。從不同降溫時長的處理來看，4 d處理下的半纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶活性更強；6 d處理下漆酶酶活性更強，其分解木質素的能力更強；8 d處理下的羧甲基纖維素酶和蛋白酶活性整體更高，分解纖維素、降解蛋白質的能力更強。

多糖是雙孢蘑菇等食用菌中重要的成分，食用菌子實體發生時，營養菌絲和子實體的細胞壁多糖結構和組分顯著不同。食用菌的營養菌絲和子實體細胞壁的可溶性多糖含量和多糖中單糖比例不同，2種細胞壁的糖苷鍵和多糖構象也不同[24]。因此可通過分析雙孢蘑菇從菌絲萌發到子實體形成過程中，各階段的可溶性多糖含量和多糖中單糖比例；研究多糖類成分的變化與子實體的發生發育間的關系；以及雙孢蘑菇生成過程中環境因素對其子實體及其活性成分的影響，從而探索雙孢蘑菇菌絲從營養生長轉化到子實體發生發育過程中的內在生長發育機制。不同降溫時長處理下2個生長期的多糖含量變化趨勢不同，總體上采收期多糖含量均高于降溫期，這與唐川[25]認為子實體采收期多糖含量高于現蕾期（即第Ⅰ期）的結論較為符合。第Ⅰ期階段，降溫處理的時長越長多糖含量越高；而第Ⅱ期階段，處理的時長越長多糖含量越低，4 d處理下菌絲體能產生更多多糖成分。雙孢蘑菇產量與采收期多糖含量變化趨勢相同，產量隨著降溫時長的增加而降低，4 d處理下產量最高。

基質中胞外酶的變化能反應出菌絲生理生化的活躍程度和基質中化學組分的降解特性，與菌絲的生長發育及生物量息息相關[5]。利用Pearson相關性法分析胞外酶活力與多糖含量、產量進行分析，發現淀粉酶活力對多糖的積累呈現顯著負相關；蛋白酶活力表現強正相關。因此淀粉酶和蛋白酶活力可以作為分析雙孢蘑菇分泌多糖能力的一個評價指標。羧甲基纖維素酶活力對產量的影響呈現顯著負相關；半纖維素酶活力表現強正相關。因此羧甲基纖維素酶和半纖維素酶活力可以作為影響雙孢蘑菇子實體產量的一個評價指標。但其作用機制還需要進一步探討和驗證。

多糖是以葡萄糖、半乳糖等單糖作為結構單元，通過糖苷鍵以線性或分支形式連接而形成的生物大分子，目前關于多糖的結構分析主要集中在其一級結構解析等方面[26]。通過比較8種單糖標準品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時間，定性分析雙孢蘑菇菌絲多糖的單糖組成。雙孢蘑菇多糖由鼠李糖、巖藻糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，這與趙肖通[9]研究結果一致；不同降溫處理下其單糖的摩爾比不同。雙孢蘑菇從降溫期到采收期，其多糖主要組分中葡萄糖、半乳糖含量逐漸增加。這可能是由于此過程中羧甲基纖維素酶和半纖維素酶逐漸增加；因為纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，是植物細胞壁的主要成分；而半纖維素是由幾種不同類型的單糖構成的異質多聚體，包括半乳糖、甘露糖等。受時間和試驗條件的限制，此次僅對雙孢蘑菇多糖的單糖組分進行了初步的研究，在空間構象分析及抗氧化活性等方面有待更深入的研究。

4 結論

以漆酶活性、半纖維素酶活性、羧甲基纖維素酶活性、蛋白酶活性、淀粉酶活性、多糖含量及其單糖組分、子實體產量為測定指標，對不同降溫時長處理措施進行綜合評價，研究不同降溫時長處理下的胞外酶活力，可為雙孢蘑菇工廠化培養料配方選擇提供理論依據。于4天內完成21.5℃到17.5℃的勻速降溫處理，能使雙孢蘑菇具有高產和富含多糖的優勢。此研究結果可為工廠化栽培雙孢蘑菇催蕾期環境調控提供科學理論，解決生產中的實際問題，促進雙孢蘑菇產業健康發展。